含酚污水降解菌的分离

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1、含酚污水降解菌的分离一、目的要求学习从含酚工业废水、活性污泥中筛选苯酚降解菌。学习通过活性污泥培养驯化和分离耐酚菌二、实验原理许多微生物可从不同基物中获取能量，具有降解某些特殊污染物的能力，这是目前环境微生物研究的重点。本次实验以含酚污水降解菌的分离、纯化与筛选为例，介绍某些特殊污染物微生物降解菌的筛选方法。梯度平板法分离纯化—般微生物在含苯酚培养基上不能生长，苯酚耐受菌株的筛选，可采用与筛选药物抗性菌株一样的梯度平扳法。即在培养基中加入—定量的药物。使大量细胞中的少数抗性菌细胞在平板上的一定剂量药品的部位

2、长成菌落。从而判定该菌耐苯酚的能力。三、实验材料1、菌源含酚工业污水或含酚废水曝气池中的活性污泥2、培养基耐酚细菌培养基，包括固体（平板、斜面）和液体两种。固体：牛肉膏蛋白胨固体培养基，灭菌后加入苯酚至6g/L。3、其他物品稀释分离所用的装有无菌水的试管，每组6支。无菌移液管，每组2支。四、步骤实验分离——耐酚菌驯化——性能测定四、实验内容1．梯度平板制备在已灭过菌的培养皿中，先倾倒7－10ml不含苯酚的已灭过菌的细菌或真菌培养基，将培养皿一侧放置木条上，使皿中的培养基倾斜成斜面，而且刚好完全盖住培养皿底部

3、，待培养基凝固后，将培养皿放平，再倾倒7－10m1已融化的无菌耐酚真菌培养基或耐酚细菌培养基(苯酚终浓度为75mg/100m1)，刚好完全盖住下层斜面，由于苯酚的扩散作用，上层培养基薄的部分苯酚浓度大大降低，造成上层培养基由厚到薄苯酚浓度递减的梯度(图6－4－2)。（一）分离酚降解菌1．梯度平板制备在已灭过菌的培养皿中，先倾倒7－10ml不含苯酚的已灭过菌的细菌培养基，将培养皿一侧放置木条上，使皿中的培养基倾斜成斜面，而且刚好完全盖住培养皿底部，待培养基凝固后，将培养皿放平，再倾倒7－10m1已融化的无菌耐

4、酚细菌培养基(苯酚终浓度为6g/L)，刚好完全盖住下层斜面，由于苯酚的扩散作用，上层培养基薄的部分苯酚浓度大大降低，造成上层培养基由厚到薄苯酚浓度递减的梯度梯度平板制备及菌落生长情况2．涂布法分离将采集的样品按稀释涂布法分离，37℃培养2d后，半板上生长的菌落也形成密度梯度，上层培养基薄的部分苯酚低浓度区形成菌苔较多、上层培养基厚的部分苯酚高浓度区出现稀少菌落。将此菌落在耐酚细菌培养基平板或耐酚真菌培养基平板上连续划线分离，最后挑取单菌落接种到耐酚斜面培养基上，37℃培养2d。（二）耐酚菌驯化先活性污泥、放

5、入苯酚无机培养液中、30℃振荡培养6—10d，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰对酚不适应的微生物；再添加苯酚无机培养液(苯酚终浓度增加至100mg/L30℃振荡培养4—6d。再流加苯酚无机培养液(苯酚终浓度增加至200mg/L)30℃振荡培养4—6d，再提高到加250mg/L苯酚无机培养液，30℃培养4d后从中选出对苯酚耐受力强的苯酚降解（三）性能测定1、初筛制备不同浓度苯酚含量的平板培养基，将选出的耐酚力强的菌株在其上分别划线分离，自高酚浓度平板上长出的菌落，即为苯酚降解力高的菌株。复筛。2、复筛将经初筛纯化的

6、菌种，分别接入碳源对照培养液和苯酚培养液中，20℃振荡培养48h，于发酵的0、12、24、36、48h取样，在OD600处检测光密度值(OD)。绘制在葡萄糖培养液和苯酚培养液上的生长曲线，在苯酚培养液中生长速度下降不明显者为耐酚菌株。思考题说明采用梯度平板法进行药物抗性菌株筛选的优越性。