基因工程--工具酶1

《基因工程--工具酶1》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、工具酶载体第四章工具酶工具酶基因工程技术中能用于DNA和RNA的合成、连接、切割和修饰的各种酶。包括：限制酶,核酸酶.聚合酶,连接酶,激酶,磷酸酶,第一节限制性内切酶（RestrictionEndonuclease）一.细菌的限制一修饰现象被发现瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论：核酸内切酶降解细菌外源DNA,修饰酶保护自身DNAArber首次从E.ColiB菌株中分离出Ⅰ型限制酶EcoB美Hopkings大学H.Smith从流感嗜血菌中分离Ⅱ型限制酶Arber,Smith获得1978年Nobel奖二.限制酶系统分类和命

2、名1985年后大量限制酶被发现，已从350多种微生物中发现2000多种限制酶，识别108种不同的特定序列限制性内切酶的分类Ⅰ型:特异识别、随机切割Ⅱ型：特异识别、同点切割Ⅲ型：特异识别、异地切割通常所指的限制酶即Ⅱ类酶限制酶特性比较I型II型III型限制与修饰由同一酶承担是否是酶反应辅助因子ATP.mg++SAMmg++ATP.mg++SAM识别位点特性/4-6bp回文对称/切割位点距离>1kb识别点中距3端24-26bp举例EcoBBamHIEcoPL识别位点TGAN8TGCTGGATTCAGACC克隆工作中用途无有无SAM:

3、硫一腺苷甲硫氨酸三.系统命名法限制性内切酶的命名方法属名种变种序数1字母2字母1字母(EcoRI)EcoRI(HindIII)HindIII(BamHI)BamHI四.一般限制酶的识别特点1.大多数是严格的识别顺序，少数可变2.识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长3.多数识别位点具有旋转对称性，少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性4bpHpaⅠCCGGHaeⅢGGCC5bpAvaⅡGGWCCEcoRⅡCCWGG6bpBamHⅠGGATTCSmaⅠCCCGGG11bpBg1ⅠGCCNNNNNGG

4、C12bpBstXⅠCCANNNNNNTGCN=A,T,G,C五.限制酶的切割末端5粘端（EcoRI）3粘端（PstI）平端（SmaI）六.限制酶产生的末端的连接1.匹配粘端:直接连接2.平末端:万能连接3.不匹配粘端：S1Nuclease切去突出端或Klenow补平七.识别位点与切割方式之间的关系1.识别不同，切割不同eg:BamHIEcoRI-GGATCC--AGATCT--CCTAGG--TCTAGA-2.识别不同，切割产生末端相同(同尾酶)eg:BamHIBg1Ⅱ-AGATCT-GGATCC-TCT

5、AGA-CCTAGG3.识别相同，切割不同eg:SmaIXmaI-CCCGGG--CCCGG-GGGCCC--GGGCCC-4．识别相同，切割相同──同工酶同裂酶eg:HpaⅡMspⅠ-CCGG--C*CGG--GGCC--GGCC-八.限制酶反应的影响因素1.温度：一般37C，有例外,如：SmaI25C，BclI50C，TaqI65C2.缓冲液：高、中、低盐之分(NaCl)3.时间：1-1.5小时4.反应体积和甘油浓度：酶<1/10体积5.DNA纯度与构型：(1）纯度：RNA，蛋白，氯仿，SDS，ED

6、TA，EB，酚，乙醇，硫酸根，DNA(2)构型：切超螺旋需更多的酶例:lgDNA,EcoRI切,1U超螺旋pUCl9,EcoRI2.5UHindⅢ5USalI10UNarI20U酶单位的定义：1U：50ul反应体积中，1小时内酶完全切割1ugDNA所需要的酶量缓冲液NaCl0,50,100mmol/L离子强度Tris-HClpH7.5-8.0MgCl2激活因子DTT保护还原性基因近末端的切割：eg:AccIGGTCGACC切不动CGGTCGACCG切不动CCGGTCGACCGG切不动eg:EcoRIGGAATTCCC

7、GGAATTCCG2小时内90%完全酶切eg:PmeIGTTTAAAC20小时不能切GGTTTAAACC20小时，25%切开GGGTTTAAACCC20小时，50%切开AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG20小时，90%切开星号反应(StarActivity)识别专一性下降eg:EcoRIGAATTCEcoRI*AATT原因：甘油浓度过高，酶浓度太大，离子强度不适，pH不适(Ph>8.0)存在有害试剂(>1%乙醇,DMSO,乙二醇)阳离子变化:Mn++,Co++,Zn++,Cu++代替mg++酶的灭活1.加热2.酚抽

8、提第二节修饰酶一.分类细菌DNA聚合酶*E.ColiDNA聚合酶（全酶）*Klenow酶T4噬菌体DNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶*测序酶（修饰的T7pol）*TaqDNA聚合酶*反转录酶末端脱氧核苷酸转移酶依赖