基因工程原理-杨红-final

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1、基因工程原理PrincipleofGeneEngineering杨红第一章第一节基因工程原理LiaoningNormalUniversityLNNU第四章第四章目的基因的分离与修饰第一节基因的基本结构特征第二节基因组文库第三节目的基因的分离与制备第四节基因突变与修饰第一章第一节基因工程原理一个能转录、翻译的结构基因依次包括：转录启动区核糖体识别区编码区转录终止区起始密码子ATG开放阅读框终止密码子（TAG、TAA、TGA）第一节基因的基本结构特征一、原核生物基因的组成基因区启动区SD区转录终止子和终止因子原核生物基因启动区的结构乳糖操纵子模

2、型二、真核生物基因的组成基因区转录启动区转录区三、其它基因组的基因组成编码区启动子终止子质粒基因病毒（噬菌体）基因：多顺反子、重叠基因、内含子线粒体基因：多顺反子叶绿体基因：多顺反子四、基因的排列重叠基因：是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。重复基因：重复基因指染色体上存在多数拷贝基因，重复基因往往是生命活动最基本，最重要的功能相关的基因。加倍基因基因重排：基因的可变区通过基因的转座、DNA的断裂错接而使正常基因顺序发生改变的现象。尤指在B细胞分化过程中抗体基因的重排及T细胞抗原

3、受体基因的重排，是基因差别表达的一种调控方式。第二节基因组文库基因组文库（DNA文库）：某种生物的基因组DNA通过克隆载体储存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的DNA文库。cDNA文库：某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这个群体叫cDNA文库。基因文库（genelibrary)——某种生物的全部遗传信息通过克隆载体储存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因文库。1.基因组文库的大小——是指文库中的克隆子数量。基因组文库的克隆数目=基因组DN

4、A总长DNA插入片段的平均长例如：某生物基因组的总长3×106kb，酶切后DNA平均长15kb，则其基因组文库的克隆子数为：3×106kb/15kb=2×105个一、原核生物基因组文库的构建1976年，Clark等提出估算克隆子数的公式。N=ln（1-P）/ln（1-f）N：基因组文库必需的克隆数目P：文库中目的基因出现的概率（99%）f：插入片段大小于基因组大小的比值例如上面例子：N=ln（1-0.99）/ln（1-15/3×106）=9×105个为了保证基因组文库具有代表性，一般构建基因组文库的实际克隆子数应该比上述计算值大2—3倍与基

5、因组大小成正比与克隆的DNA片段大小成反比与载体的容量有关：某一生物如果用质粒作载体需要900万个克隆，用λ噬菌体需要90万个克隆，用cosmid作载体需要35万个克隆。2.用于构建DNA文库的克隆载体λEMBL系列、λDASH、λ2001等优点：载体双臂DNA序列已经确定有易于筛选的遗传标记λEMBL和λ2001有Spi-标记易于从重组噬菌体中回收插入的外源片段。（1）制备基因组DNA并片段化3.构建基因组文库的基本步骤提取总基因组DNA切割：机械方法、RE法、识别序列4位点回收：电泳、梯度离心（2）DNA片段与载体重组连接+4.原核生物

6、基因组文库的构建二、真核生物基因组文库的构建1.构建λ噬菌体基因组文库2.用Cosmid构建基因组文库3.构建酵母人工染色体基因组文库三、cDNA基因文库的构建从基因组分离基因难度大：基因以单拷贝形式存在，占染色体DNA的10-5——10–7；真核染色体DNA大，难定位基因；真核生物基因有内含子，在原核细胞表达时没有加工功能。1.cDNA文库的概念——某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这个群体叫cDNA文库。表达型cDNA文库：直接检测表达产物-蛋白质，筛选重组克

7、隆，不知道目的基因序列和蛋白氨基酸序列。非表达型cDNA文库：已知目的基因序列或蛋白氨基酸序列，可以通过杂交筛选。2.cDNA文库的构建（1）分离细胞总RNA，并从总RNA中分离纯化出mRNA总RNA包括：rRNA（80-85%）tRNA（10-15%）mRNA（1-5%总RNA的提取：与DNA的提取相似。沉淀细胞——裂解细胞——离心去残渣——上清液除蛋白——沉淀RNA。mRNA的纯化Poly（A）RNA的分离——柱层析Oligo（dT）mRNA分级：梯度离心，电泳，mRNA转译活性鉴定——无细胞体系（兔网织红细胞裂解物）——蛙卵系统（非洲

8、爪蟾卵母细胞系统）Oligo（dT）引导的cDNA合成mRNA-cDNA（2）以mRNA分子为模版，合成cDNA第一链（3）双链cDNA的合成AAAAAAAAAAAAAAA①大肠