《基因克隆工具酶》PPT课件

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1、第二章基因克隆工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶NMPNTPdNMPdNTP一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）发现：1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。限制性核酸内切酶的发现与应用导致了体外重组DNA技术的发展，使人们有可能将很大的DNA分子定向性地切割成较小的DNA片段，然后运用各种技术手段对其进行分析，从而能对生物体的基因结构、组织表达及进化问题进行深入的研究来源：主要是从原核生物中分离纯化

2、得到。到目前为止，已经从近300种不同的微生物中分离出约500种限制性核酸内切酶1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）生物学意义：限制性核酸内切酶，可以帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌中的防卫系统：限制与修饰现象（1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。（2）限制性核酸内切酶（3）甲基化酶：对该特异位点的腺嘌呤A进行甲基化修饰，被修饰的DNA

3、就不再被相应的限制酶切割了。（4）细菌自身的DNA——受到甲基化修饰，得以保存（5）外源入侵的DNA——未来得及甲基化，被降解1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（例如DH5α），必须是（1）rec基因缺陷型的突变体保证必须不与同外来DNA分子发生遗传重组（2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能2+2+2+一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）2.限

4、制性核酸内切酶的类型主要特性限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列I型多功能异源三聚体ATPMg2+SAMTGAN8TGCTAACN6GTGCII型单功能同源二聚体Mg2+旋转对称序列III型双功能异源二聚体ATPMg2+SAMGAGCCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处SAM：S-腺苷蛋氨酸Ⅱ型酶的作用方式在基因工程中具有十分重要的价值，是基因工程中常用的工具酶。Ⅰ型酶、Ⅲ型酶的使用不如Ⅱ型酶方便，切割方式不如Ⅱ型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。一、限制性核酸内切酶（restricti

5、onendonuclease）2.限制性核酸内切酶的类型属名种名株名Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株HindIIIHindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）3.限制性核酸内切酶的命名H：细菌属名的头一个字母in：细菌种名的头两个字母Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体d：代表该菌菌株名称III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，Ⅲ表示该酶是属于第三个限制修饰系统的酶一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）3.限制性核

6、酸内切酶的命名一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）4.II型限制性核酸内切酶的基本特性EcoRI的切割位点EcoRI的识别序列5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’(1)识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列(2)识别序列呈典型的旋转对称型回文结构(3)大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧EcoRI等产生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH3‘…C-G-

7、A-C-T-T-A-A-PP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃OHP5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’POH磷酸二酯键发生水解nick缺口PstI等产生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH3‘…C-G-A-G-PP-G-G-A-G…3’OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃OHP

8、5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG