《基因的重组与转移》PPT课件

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1、外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第六章基因的重组与转移第一节重组DNA分子的构建一、基因重组概念利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因，将两者连接起来，再转入受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到正确表达。二、基因重组的考虑因素实验步骤简单易行，连接效率较高，易于重组子筛选2.能够回收插入的外源基因3.外源基因必须在表达载体DNA的控制下，并置于正确的阅读框架内，以便目的基因的正确表达三、表达载体DNA理想的酶切位点应该符合下面几个条件1.载体上特定的酶切位点尽可能少最好是单一酶切位点2.酶切位

2、点之前要有一个较强的启动子高效表达（一）粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起四、载体DNA与外源基因片段的连接1.两段DNA的连接依靠粘性末端2.DNA片段与载体的连接依靠粘性末端ligasenick(二)平齐末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4－DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’（1）同聚加尾法2.人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DN

3、A的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）连接子(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段8-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：（3）DNA接头(ada

4、pter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter用T4－DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接头自

5、我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP处理-OHHO-Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-G

6、GCC-p5’BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。(三)PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5’--3’GCAGAATTC互

7、补序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互补序列PCR产物5’--3’3’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列模板BamHI位点-5’3-’5’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGGPCR产物互补序列-5’3’-引物2带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--3’GCTAGCCGGPCR产物-5’3’-CGTCTT