实验4乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白

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1、生物化学实验之－－山东师范大学生命科学学院实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白【实验目的】学习乙酸纤维素薄膜电泳的原理，掌握有关操作技术。【实验原理】电泳:带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的方向泳动的现象。由于被分离物质所带电荷的性质、数量和分子的大小以及形状不同，在同一电场作用下其移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率（μ）不同。因此，经过一定时间电泳后即可被分离开来。利用此性质，将混合物中各组分进行分离分析的方法称为电泳法。影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。影响电泳迁移率的

2、内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。血清蛋白组分蛋白质名称等电点（pI）相对分子质量白蛋白α1－球蛋白α2－球蛋白β－球蛋白γ－球蛋白4.85.065.065.126.85~7.56900020000030000090000~150000156000~300000血清中各主要蛋白质的等电点均低于pH8.6，在该缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极移动。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条主要区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白。【实验材料与

3、试剂】（一）醋酸纤维薄膜（2×8cm）、电泳仪、电泳槽、点样器（盖玻片）、载玻片、培养皿、镊子（二）新鲜血清、巴比妥/钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）、染色液（氨基黑10B）、漂洗液【实验步骤】1.薄膜的处理⑴将醋酸纤维薄膜置于盛有巴比妥/钠缓冲液的平皿中，浸泡30min以上。⑵用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸去多余的缓冲液，然后平铺在载玻片上（无光泽面朝上）。用毛细管取一滴血清，滴在另一载玻片上，用盖玻片的一侧边在血清上均匀蘸一下，再轻轻印在薄膜点样处片刻，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线。2.点样3.电泳⑴将薄

4、膜平贴在电泳槽支架上，点样端在阴极。两端用已浸透缓冲液的纱布压住（引桥）。⑵盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。连接电源、电极线。⑶通电，调节电压至100V，电流强度为0.4～0.6mA/cm膜宽度，电泳时间约45~60min。4.染色电泳完毕后将薄膜取下,放在氨基黑10B染色液中浸泡5~10min。5.漂洗将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱。+-【注意事项】1.市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的选择与浸润是电泳成败的关键之一。若浸透后的薄膜色泽均匀，深浅一致，则可

5、用于电泳。2.醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥－巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.05～0.09mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。3.点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不齐，影响分离效果。4.点样时，点样不要过多，恰到好处，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。5.放薄膜的时候要注意放平，与纱布充分接触，但不要接触点样端。6.电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4～0.6mA/cm膜宽度。电流强

6、度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。