实验质粒DNA的转化

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1、实验四、质粒DNA的转化一实验目的二实验原理三材料仪器四实验步骤五实验结果图六结果讨论七思考题一、实验目的学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。转化（transformation）:把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。当受体菌处于感受态时，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。在培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到

2、表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子（transformant）。二、实验原理三、材料仪器实验仪器超净工作台、恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、涂布棒，微量取样器，冰盒等。实验材料大肠杆菌DH5α感受态细胞；质粒DNA:pCR4ToPoGt5GT7(Kan+Amp抗性)；LB固体培养基；含Kan+Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp和Kan储存液，使终浓度分别为50µg/ml，摇匀后铺板。1．从冰箱中取出感受态细胞，放置冰上；2．每组分别取2管20µl感受态细胞悬液；第

3、一管为转化实验组：1µl重组质粒DNA+20µl感受态细胞；第二管为阴性对照组；加入1µl无菌水+20µl感受态细胞悬液；轻轻摇匀，冰上放置30分钟；3．将管放入42℃恒温水浴中90秒，迅速将eppendorf管移到冰浴上，冷却2min；四、实验步骤+420C热击370C复苏Kan+Amp筛选感受态细胞质粒DNA4.向上述eppendorf管中加入200uLLB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养20min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因；5.将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Kan+Amp的筛选平板上，

4、涂布之后，在37℃培养箱中正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16小时；6.涂布细则如下表：组别培养皿编号DNA/μl灭菌水/μl平板抗性受体菌/μl11-1-对照-无—1无1001-1-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-1-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10021-2-对照-无—1无1001-2-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-2-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10031-3-对照-无—1无1001-3-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-

5、3-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10041-4-对照-无—1无1001-4-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-4-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10051-5-对照-无—1无1001-5-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-5-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan100组别培养皿编号DNA/μl灭菌水/μl平板抗性受体菌/μl61-6-对照-无—1无1001-6-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-6-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10071-7-对照-无—1无1001

6、-7-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-7-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10081-8-对照-无—1无1001-8-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-8-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10091-9-对照-无—1无1001-9-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-9-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan100涂布棒的使用1、使用前，浸入75%酒精中；2、在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精（不要烧到手）；3、等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；4、涂布均匀；5、将涂布棒重新除菌以备下

7、一次使用；6、阴性对照与重组DNA的涂布棒区别使用，避免DNA污染。A(对照-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培养基，菌落生长情况;B(转化-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培养基，菌落生长情况;C(对照-无):100ul菌液涂布于LB培养基，菌落生长情况;BCA五、实验结果图六、结果讨论转化过程中的影响因素1．受体细胞的生长状态和密度细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的A600控制。2．质粒DNA的质量和浓

8、度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但外源DNA的量过多时，则会使转化率下降。一般来讲，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50µl的