《目的基因的获取》PPT课件

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1、第四章目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。结构基因的组成转录启动区核糖体识别区编码区转录终止区起译码ATG开读框休止码TAG、TAA、TGA目的基因的获取方法1、直接分离法2、基因文库分离法3、PCR分离法4、化学合成法比较各种方法获得目的基因的优缺点第一节直接分离法一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene

2、适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少,获得也比较简单.应用对象1、对已定序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。2、对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。3、即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从钩出目的基因。二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶

3、的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片

4、断。三、物理化学法基本原理：DNA分子的两条链存在着G≡C、A＝T碱基配对，其中GC间存在3个氢键、AT间存在2个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。密度梯度离心法非洲爪瞻5SDNA单链酶解法根据其热稳定海胆DNA目的基因的获取方法1、直接分离法2、基因文库分离法3、PCR分离法4、化学合成法将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存

5、和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。一、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）第二节构建基因组文库分离法（2）目前常用的载体2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为36.4~51kpcosmid载体：容量为45kbYAC：容量为230kb-1700kbBAC:容量为300kb断点完全随机，片断长度合适于载

6、体连接。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。②酶切法：（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末

7、端③同聚物加尾4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3

8、×1091.7×104=8.1×1051.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文库的构建mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）