高纯度原代大鼠肝细胞的分离与培养

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1、·822·　第16卷　第11期医学研究生学报Vol.16No.112003年11月JournalofMedicalPostgraduatesNov.2003·论　　著·高纯度原代大鼠肝细胞的分离与培养X王新颖,　李维勤,　李　宁,　黎介寿(南京军区南京总医院解放军普通外科研究所,江苏南京210002)摘要:目的:分离及培养高纯度的原代大鼠肝细胞。　方法:用含EGTA的D2Hanks液及含DNaseⅠ的胶原酶消化液分两步原位灌注大鼠肝脏,分离细胞经3次低速离心(50g,5min)后获得纯化的肝细胞。肝细胞存活率检测用锥虫蓝拒染法,纯度检测用苏木精2伊红染色。采

2、用加入特殊营养成分的RPMI1640培养液培养,用倒置相差显8微镜观察细胞活力。　结果:每只180～200g的大鼠平均可获(1.0～1.5)×10的细胞,存活率>50%,纯度高于98%。培养1、3、5天肝细胞的存活率分别为100%、94.5%、89.5%,形态良好。　结论:改良原位灌注消化法分离肝细胞产率较高,活性较好,加入特殊营养成分的RPMI1640培养液培养能保持肝细胞良好的形态。关键词:肝细胞;　分离;　培养;　大鼠中图分类号:Q813.11　　　文献标识码:A　　　文章编号:100828199(2003)1120822203Separationan

3、dcultureofhigh2purityprimaryrathepatocyteWANGXin2ying,LIWei2qin,LINing,LIJie2shou(ResearchInstituteofGeneralSurgery,NanjingGeneralHospitalofNanjingCommand,Nanjing210002,Jiangsu,China)Abstract:Objectives:Toestablishamethodofseparationandcultureofhigh2purityprimaryrathepatocyte.Metho

4、ds:TheperfusionsolutionsusedinthefirstandthesecondstepwereD2Hank’ssolutioncontainingEGTA,andthedigestivesolutioncontainedDNaseIandcollagenaserespectively.Purifiedhepatocyteswereseparatedfromthedissociativecellsbylow2speedcentrifugation(50g,5min)3times.Thesurvivalratewasmeasuredbyty

5、panblueexclusionandthepuritywasmeasuredbyroutinehematoxylinand2eosincytochemistry.SeparatedhepatocyteswereculturedinRPMI1640cul2turemediumwithsomespecialnutrientelements.Throughouttheinvitroculture,wekeptcontinu2ousobservationoftheshapechangesofthehepatocyteandmeasuredthesurvivalra

6、tewithinthefirst58days.Results:(1.0～1.5)×10cellswerepreparedfroma180-200gratonaverage,thesurvivalratewashigherthan50%andthehepatocytepuritywashigherthan98%.Microscopically,thehepa2tocyteswerenormalinshapeandviability.Conclusions:Themodifiedinsituperfusiondigestionmethodandthecultur

7、einRPMI1640andspecialnutrientsareadvantageoustogethighviabilityandpurityhepatocytewithnormalshape.Keywords:Hepatocyte;Separation;Culture;Rat虽然目前国内外在这些领域的研究中应用大鼠体外0引　　言肝细胞已非常普遍,但由于肝细胞体外培养增生困体外培养的大鼠原代肝细胞是研究毒理学、药难,而且难以长期维持功能。因此,如何获得高存活理学、生物化学及致癌作用的有效手段,同时也是研[1～2]率、高产率的原代肝细胞仍然是人们关心的问题。

8、究感染状况下肝急性相反应良好的体外模型。X收稿日期: