《酶抑制法》PPT课件

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1、第七章残留农药的检测方法-酶抑制法农兽药残留检测-酶抑制法实际上，最容易引起农药食物中毒的当属有机磷类杀虫剂。我国专家江希流曾对为数众多的农药品种进行过分级排队，从中筛选出了十种强污染的农药，其中有七种为有机磷类，即敌百虫、敌敌畏、乐果、氧化乐果、对硫磷、甲基对硫磷、甲胺磷，其他三种为杀虫双、杀虫眯和除草醚。氨基甲酸酯类农药毒作用机理与有机磷农药相似，主要是抑制胆碱酯酶活性.农兽药残留检测-酶抑制法二、检测原理利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对动物体内乙酰胆碱酯酶（AChE）具有抑制作用的原理，在乙酰胆碱酯酶及其底物（乙酰胆碱）的共存体系中加入农产品样品提取液（样品中含有水），如果样品中不含有机磷

2、或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就不被抑制，乙酰胆碱就会被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应就会产生颜色；反之，如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试样中加入的底物就不能被酶水解，从而不显色。农兽药残留检测-酶抑制法水解加酶显色剂未水解显色剂不显色显色无农药有农药农兽药残留检测-酶抑制法用目测颜色的变化或分光光度计测定吸光度值，计算出抑制率，就可以判断出样品中农药残留的情况。AChE属于丝氨酸为中心的酶类，羧酸酯酶（非特异性酯酶的一种）与AChE类似，同样以丝氨酸残基作为活动中心。农兽药残留检测-酶抑制法三、酶的基质和显色反应类型1.酶的基质酶抑制剂显色反应可使

3、用的基质（底物）和显色剂很多。各种乙酰胆碱（ACh）、乙酰萘酯以及其他羧酸酯、乙酸羟基吲哚及其衍生物考虑：灵敏度，适用性，酶源、基质、显色剂获得难易农兽药残留检测-酶抑制法1.肉眼观察法酶片法、试纸法、速测卡法基于反应体系反应前后明显的颜色变化来观察、判断农药毒性高低的一种定性测量方法。一般选用靛酚乙酸酯（红色）为底物。四、检测方法农兽药残留检测-酶抑制法原理是：胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药。美国于1985年曾报道了一种称为农药检测器的

4、酶片，可在田间快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药，其灵敏度在0.1~10mg/kg范围。农兽药残留检测-酶抑制法速测卡法华南农大植保系和深圳天福贸易有限公司推出的“农药速测卡”广州进出口食品检验研究中心与广州天河绿洲生物化学研究中心联合研制生产的“农药检测卡”农兽药残留检测-酶抑制法速测卡以滤纸作载体，白纸片上载有乙酰胆碱酯酶和基质，红纸片载有显色剂。当空白样品加于白纸片上，在酶作用下，乙酰胆碱与水发生水解，水解产物与显色剂反应产生颜色。当含有有机磷和氨基甲酸醋类农药的样品加于白纸片上时，抑制了乙酰胆碱酯酶的活性，使这种酶不能被水解，从而无显色反应。农兽药残留检测-酶抑制法白色药片变成蓝色，说明

5、农药残留无或在检出限下；白色药片不变蓝，说明含有超出检出限的农药。农兽药残留检测-酶抑制法农兽药残留检测-酶抑制法农药速测卡对几种常用农药的最低检测限（单位mg/kg）如下：甲胺磷1.7马拉硫磷2.0水胺硫磷3.1对硫磷1.7久效磷2.5乙酰甲胺磷3.5敌敌畏0.3乐果1.3敌百虫0.3呋喃丹0.5西维因2.5好年冬1.0农兽药残留检测-酶抑制法（1）整体测定法选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10ml纯净水或0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液〔水与菜叶的比例以(1:l)~(l:2）为宜〕，震摇50次，静置2min以上。取一片速测卡，用白

6、色药片蘸取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。每批测定应设一个纯净水或缓冲液的空白对照卡。农兽药残留检测-酶抑制法（2）表面测定法擦去蔬菜表面泥土，滴2~3滴洗脱液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上．放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生

7、反应。每批测定应设一个洗脱液的空白对照卡。农兽药残留检测-酶抑制法速测卡使用经验:①由于菜叶含有大量的叶绿素，若菜叶剪得太碎，叶绿素颜色会对阴性反应的蓝色观察有影响，对农药速测卡的初次使用者易产生错误的判断。②可疑阳性试样是根据显色反应的蓝色比空白浅，比阳性深而判定的。蓝色变浅程度存在差异，且有部分叶绿素的影响，农兽药残留检测-酶抑制法③农药速测卡使用的最佳pH值是7.5，若样液的pH值偏离太大，