《酶联免疫分析技术》PPT课件

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1、2013-8-131酶联免疫分析技术——ELISA检测免疫检验利用免疫检测原理检测与免疫相关的物质（抗原、抗体、补体、细胞因子等）北京世纪坛医院李莉免疫检验技术1.酶联免疫分析技术2.放射免疫分析技术3.荧光免疫分析技术4.化学发光免疫分析技术5.金标免疫分析技术6.免疫印迹技术7.免疫电泳技术等酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)利用免疫检测原理检测体液中的微量物质（激素、酶、血浆中的微量蛋白、药物浓度等）这些检测结果为临床上确定诊断，分析病情，调整治疗方案

2、和判断预后提供有效的实验依据。酶联免疫分析技术是以酶标记抗原/抗体为主要试剂的一种标记免疫分析技术，利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原抗体免疫学反应检测的敏感性.历史1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。AbAg和Ab分离，然后测定AbAg或Ab的量，2013-8-13酶联免疫吸附实验的

3、原理以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。因为结合了免疫反应和酶催化反应，所以是一种特异而又敏感的技术。酶免疫技术Ab*+AgAb*Ag+Ab*异相法：****从而推算出Ag量。Ag*过量Ab*AbAg*Ab均相法：Ab*Ag中的标记物*失去特性，直接测定游离Ab*的量，从而推算出Ag量。Ag*过量Ab*AbAg*Ab1特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离

4、待检物。22最适比例2013-8-133敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。特点灵敏度高特异性强准确性好试剂稳定方法简便酶联免疫吸附实验方法类型：酶联免疫吸附实验的分类双抗体夹心法（三明志法）原理固相支持物表面3包被抗体标记抗体待测物底物一步法ELISA反应会出现钩状效应1.双抗体夹心法（主要用于测抗原）2.间接法（主要用于

5、测抗体）3.竞争法（主要用于测小分子抗原/半抗原和抗体）4.捕获法（主要用于测血清中某抗体的亚型）钩状效应（hookeffect）一般情况下的双抗体夹心法ELISA反应抗原过量时2013-8-13间接法原理间接法的影响因素正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体对间接法的影包被物底物待测物底物标记抗体待测抗体标记抗原包被抗体固相支持物表面竞争法测抗原的原理（7）酶反应终止液。固相支持物表面响抗原的纯度对间接法测抗体的影响ELISA试剂盒组分：ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的

6、固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；结合物即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂1酶的催化活性2抗体（或抗原）的免疫活性3含有或少含有游离的抗体（或抗原）4结合物尚要有良好的稳定性。4酶标记的抗原或抗体酶标抗原天然抗原重组抗原合成多肽抗原酶标抗体单抗多抗酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺

7、基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,4504202013-8-13酶及底物HRP的底物DH2+H2O2D+2H2O上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。D

8、H2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。ETMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色