模块四逆境胁迫对植物生理生化指标的1

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1、逆境胁迫对植物生理生化指标的影响李忠光，2011.5.25模块四综合性实验目的掌握逆境胁迫下一些植物生理指标的测定方法；了解逆境胁迫下植物生理生化指标的变化以及逆境伤害和适应的原因。流程图根据生物膜透性根据呼吸作用染料法纸上荧光法：种皮的透性，十字花科5%红墨水染色法0.1%靛蓝、曙红等染色法TTC法:作为H受体BTB法：外界pH的变化I2-KI染色法：松、衫科种子实验原理I实验原理I实验原理ITTCMethodDyeMethod实验原理II4260nm实验原理III实验原理IV实验原理V实验原理VIPODPP

2、O实验原理VII对硫二硝基苯酸实验原理VIIICitedfromPlantPhysiology,2003,131:697-706实验方法I种子发芽率的测定：各取50粒吸胀的玉米种子或小麦种子→沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验：其中50个半粒进行TTC染色（30℃水浴20min）另50个半粒进行曙红染色（室温染色10min）根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。品种为晴3或鲁玉13的玉米种子或小麦种子（购于西山种子公司）→用0.1%HgCl2消毒10min后→用蒸馏水漂洗干净→用蒸馏水于2

3、6℃下吸涨12h→播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm×16cm）中→于26℃下暗萌发60h→计算发芽率（注意与前面结果比较）→选取长势一致的玉米幼苗做干旱5天、高温、盐渍或低温下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。实验方法I呼吸作用的测定：材料的准备：将预测量的材料称重后（0.5g）放入测量瓶。测定方法：打开电源预热5min→打开气泵开关→打开闭路开关→用碱石灰管分别连接面板上的“OUT”和“IN”，主机的“OUT1”和“IN1”分别与测量瓶的“OUT1”和“IN1”相连→立即开始记时→测量1min的CO

4、2增加量计算：每分钟每克材料的CO2释放量（mL.g-1.min-1）。实验方法IIPro的提取：分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。测定：上清液各2mL→分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心10min（若没沉淀可略此步骤）→分别测定A520计算：Procontent=(mmol.g-1FW)实验方法IIIMDA提取：分别取0.1g

5、实验组和对照组→加入3mL10%TCA和少许石英砂→充分研磨→用2mL10%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。测定：分别取上清液各2mL→加入0.6%TBA（用10%TCA配制）2mL→煮沸12min→冷却后→5000rpm离心5min（视沉淀有无）→分别测定OD450和OD532计算：实验方法IVH2O2提取：分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL50mMPBS(pH=6.8，内含1mMHA)和少许石英砂→充分研磨→用2mLPBS洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容

6、至5mL。测定：分别取上清液各3mL→加入0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]1mL→摇匀→5000rpm离心10min→OD410计算：H2O2content=(mmol.g-1FW)实验方法V实验方法VI1、抗氧化酶的提取：分别取0.1g实验材料→加入少许石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS,pH6.0,内含0.１mmol/LEDTA,1%PVP）→充分研磨→转入离心管中→用2ml提取液洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5ml→用于测定POD和PPO酶活性或分

7、装后转至-20或-80℃保存。2、POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）2.95ml，加入酶液50ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应2min时的A470。3、PPO测定：取PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.9ml，加入酶液0.1ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应2min时的A410。以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：实验方法VIPODactivities=

8、(mmol.g-1FWmin-1)PPOactivities=(U.g-1FW)4、计算实验方法VI实验方法VIIGSH的提取：分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。测定：上清液各1mL(空白用5%三氯乙酸代替)→分别加入2mL0.1MPBS(pH=7.7