生物分离工程第5章-初级分离

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1、初级分离第五章初级分离：是指从菌体发酵液、细胞培养液、胞内提取液（细胞破碎液）及其他各种生物原料中，初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。初级分离的对象具有体积大、杂质含量高等特点，因此初级分离技术应具有操作成本低、适合大规模生产的优势。初级分离方法：固液分离（离心、过滤）、膜分离、萃取、吸附、沉淀分级和泡沫分离等。第一节杂质种类高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）杂蛋白在采用离子交换纯化时，会影响树脂对生化物质的交换容量。在采用离子交换和吸附法提取时，会降低其交换容量和吸附能力在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。在

2、常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。c.多糖d.色素（一）高价无机离子的去除方法Ca2+——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）；Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；Fe2+——黄血盐，→普鲁士兰沉淀（二）杂蛋白的去除方法等电点沉淀：蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。在酸性溶液中带正电荷；在碱性溶液中带负电荷。在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。1.沉淀法：等电点沉淀、酸碱沉淀在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，蛋白质与一

3、些阳离子，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。酸碱沉淀：使蛋白质与盐或离子形成沉淀。2.变性法①加热；②大幅度调节pH值；③加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去

4、。这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法，也可以作为提取目标产物的技术手段。3.吸附法酶解法可将混合液中的不溶性多糖物质酶解，使其转化为溶解度较大的单糖，从而改变流体的流动特性，提高过滤速率。例如：万古霉素用淀粉作培养基，发酵完成后，发酵液中多余的淀粉使混合液粘度较大，当加入0.025％的淀粉酶后，搅拌30min，再加2.5％助滤剂（硅藻土），可使过滤速率提高5倍。（三）多糖的去除发酵液中有色物质可能是由于微生物生长代谢过程分泌的，也可能是培养基（如糖蜜、玉米浆等）带来的，色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。色素物质的去除，一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等

5、材料的吸附法来脱色最为普遍。例如活性炭可用于柠檬酸发酵液的脱色，盐型强碱性阴离子交换树脂可用于解朊酶和果胶酶溶液的脱色，磷酸型阴离子交换树脂被用于谷氨酸发酵液的脱色等。一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行。（四）有色物质的去除第二节沉淀分级沉淀（precipitation）是指由于物理环境的变化，使溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质

6、或有选择地沉淀所需成分。生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。沉淀和结晶的区别:形态：不定形成分纯度：纯度较低操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。沉淀法操作步骤：①加入沉淀剂。②沉淀剂的陈化，促进粒子生长；③离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取。优点：

7、设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产；缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度常比结晶法低，过滤也较困难。eg.从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白和96%~99%的白蛋白。图1利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图沉淀法分离蛋白质的特点：生产前期可使原料液体体积很快减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；使中间产物保持在一个中性温和的环境；可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；用蛋白质沉淀法作为色