实时荧光定量PCR的数据分析方法

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1、生物技术通讯述实时荧光定量的数据分析方法〃〃易健明，屈武斌、张成岗军事医学科学院放射与辐射医学研究所，蛋白质组学国家重点实验室，全军军事认知与心理卫生研究中心，北京安徽医科大学研究生院安徽合肥，摘要实时荧光定量是目前检测目的核酸拷贝数及分析靶基因在表达水平相对变化的主流技术。研究表明分析结果的准确性依赖于数据分析方法的可靠性。我们简要综述实时荧光定量的数据分析方法：，关键词实时荧光定量绝对定量相对定量动力学法；；中图分类号文献标识码文章编号丨，实时荧光定量指数模型数据分析法，是目前检测核酸含量以及分析基因在表达水平相对变化的主流技术“，指数模塑

2、数据分析法的理论基础认为在产具有准确性高、特异性强、灵敏度高和操作简便等优物扩增曲线的指数扩增期（图，反应体系内的引点，广泛应用于临床医学和生命科学等多个学科领物和底物过量，聚合酶过量且保持高活性，因域。反应的作原理是在反应体系此反应的扩增效率保持最大值不变，扩增产物内加入荧光基团（荧光探针或荧光染料），利用荧光的数量以指数形式增加，相应的指数函数表达式方信号积累实时检测整个反应过程，得到产物扩程为足不（￡其中足表示第轮循环反应结增曲线（图，然后采用合适的数据分析方法，计束后的扩增产物数量，表示初始模板数量表示算初始模板数量绝对定量或初始模板数

3、量的相对平均扩增效率。方程经过对数变换后，得到方程比值相对定量广。反应的数据分析方法，按照定量分析的目的，可划分为绝对定量法和相对：—定量法、按照数据分析方法基于的理论基础和数学，模型，可划分为指数模型数据分析法和动力学法。十收稿日期基金项目国家重点基础研究发展计划自：（国家然；科学基金（，，蛋白质组学国家重点实验室开放课题（，挪—，国家科技重点专项（卜】作者简介：易健明（，男，硕士研究生通信作者：屈武斌，（张成岗，（图反应的产物扩增曲线：：焚光阈值阈值循环数易健明等：实时荧光定量的数据分析方法。二。根据上述理论，指数模型增效率，衡量标准曲线的

4、质量是使数据分析法采用的数据必须来自指数扩增期，通常用个以上的数据制作标准曲线保证回归系数记通过设置荧光阈值线获得（图。大于。绝对定量法的优点是结果准确，是目前荧光阈值线是一条平行于轴的直线，其缺省设置核酸拷贝数定量分析的金标准；缺点是需要制备标值通常为基线内个循环荧光信号准品，操作繁琐对作人员的操作水平要求高。标准偏差的倍荧光阈值线与产物扩增曲线交法点的横坐标称为循环阈值，表示荧光信号到达法的丁作原理是假设靶基因和参考基因的设定荧光阈值时所经历的循环数”即可简化为。在循环阈值扩增效率均为，方程处处。，方程为，方程为荧光阈值通￡。当需要精确定量

5、核酸的拷贝数时，通常采过手动设置阈值线得到。该方法的优点是不需要计用方程进行数据分析，常用的方法为绝对定量法，算扩增效率，因此操作简便，效率高，是目前用于相一不高又称标准曲线法当需要对靶基因在表达对定量分析的主流方法之；缺点是准确度，特水平进行相对定量分析时，通常采用方程进行数别是样品中存在反应的抑制剂时，实际扩增效率会据分析。在进行相对定量分析时，为了消除样品浓显著低于理想扩增效率（因此分析结果中会度等因素引人的误差，通常需要引入内参基因对靶存在较大误差。基因的初始模板数量进行校正。假设荧光阈值为双标准曲线法处理组样品靶基因和参考基因的阈值循

6、环双标准曲线法的工作原理是扩增系列浓度梯度分别为和，扩增效率分别为瓦和良那么两的标准品（数量未知）获得各标准品的值，然后者的函数表达式分别为瓦广（。表示处理以值为纵坐标、初始模板数量的对数为横组样品靶基因的初始拷贝数和凡（瓦广尺表坐标，进行线性回归分析，通过斜率计算出扩增效率示处理组样品参考基因的初始拷贝数）。经内参基（￡。荧光阈值通过手动设置阈值线得到。最因校正后处理组样品中靶基因的初始模板数量为后将靶基因和参考基因的扩增效率幻和值代入±同理对日组样品中经参考基因校但是需難建多条标线，工作量大效率￡低后的祀基因初腿板数量为和’目前仅用于对分析

7、结果要求研究。、线性回归分析法分别为对照组样品靶基因的初始模板数量一、扩增线性回归分析法的基本原理是直接从条产物效率和阈值循环数，尺、艮和分别为对照组样品扩增曲线的指数扩增期内采集数据，以数据荧光中参考基因的初始模板数量、扩增效率和阈值循环值）的对数为纵坐标、循环数为横坐标做图，进行数。因此靶基因在表达水平的相对变化量线性回归，得到方程的斜率，继而计算出扩增效率由于参考基因的初始模板（幻。循环阔值通过手动或自动设置丨值获，量在处理组和对照组中相同兄，所以靶基因的■’‘：■‘值代入方程得到分析结果。线性分斤法相对变化量《方程。方程是指主要包括法和

8、法。。数模型数据分析法进行相对定量分析的一般方程。法首先在产物扩增曲线上分别设置基于上述方程进行相对定量分析的主要方法有—个低荧光值和一个高荧光值确定