细胞的原代培养和传代培养

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1、实验五细胞的原代培养和传代培养1.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。2.实验指导细胞培养(cellculture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能

2、和分化等研究。一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。此外，还应避免细菌及其他微生物的污

3、染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。二者可分别使用，也可共同使用。钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。原代培养和传代培养的细胞依据其生长状态，可分为贴壁生长细胞与非贴壁生长细胞。一般说

4、来，来自外周血的细胞，如红细胞、白细胞、白血病细胞等都是非贴壁细胞；而来自其他组织的细胞则多为贴壁细胞。贴壁细胞依照其镜下特征，可分为以下4种类型。①成纤维型细胞。②上皮型细胞。③游走型细胞。④多形型细胞。本次实验中原代培养的为兔肾成纤维细胞，生长状态良好时为标准的成纤维型细胞。传代培养的HeLa细胞为黑人宫颈癌细胞，为标准的上皮型细胞。3.实验材料3.1器材:手术器械一套，直径9cm培养皿一套，培养瓶4个，吸管3支，离心管2个(以上用品为每只乳兔所用)，C02培养箱，超净工作台，酒精灯，倒置显微镜，HeLa细胞。3.2试剂：0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混

5、合消化液，RPMI-1640培养液(含5%小牛血清)，0.01%PBS，75%乙醇。3.3动物：乳兔4.实验方法4.1细胞的原代培养4.1.1方法①取材:用颈椎脱位法处死乳兔，然后把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中，数秒消毒后取出(注意：浸泡时间过长，乙醇从口和肛门侵入体内会影响组织生长)，携入超净台，放在大平皿中。分别用碘酒和乙醇进行一次背部消毒，再用消毒过的剪刀剪开乳兔背部的皮肤和肌肉，取出肾脏，置于另一个无菌培养皿中。②切割:用灭菌的PBS液将取出的肾脏清洗3次，然后用眼科剪刀和镊子仔细将肾脏外包膜除去，之后将组织反复剪碎，直至剪成0.5～1mm3左右的小块

6、。再用PBS液清洗，直至组织块发白为止。然后移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到离心管的管底，弃去上清液。②消化分离:吸取0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，加上胶塞，在37℃水浴箱中消化8～10分钟，每隔几分钟轻轻摇动一下离心管，使组织与消化液充分接触。消化结束后静置3分钟，吸去上清。④接种培养：向离心管中加入5～10ml含5%小牛血清的1640培养液，用吸管吹打混匀，移入2个培养瓶中。盖好瓶塞，做好标记，置于C02培养箱中37℃培养。4.1.2结果观察细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，

7、5～7天即可形成单层。4.2细胞的传代培养4.2.1方法①将长成单层的细胞从CO2培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少量消化液(以液面覆盖住细胞即可)，之后立即弃掉消化液。②静置3～5分钟，加入3～5ml新鲜培养液(在酒精灯上进行操作)，吹打，制成细胞悬液。③将细胞悬液吸出2ml左石，加入另一无菌培养瓶中(在酒精灯上进行操作)，并向每个培养瓶中分别加入3ml左右培养液，盖好瓶塞，做好标记，送回二氧化碳培养箱中，37℃继续进行培养。4.2.2结果观察一般情况下，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶的壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，并需要再次传