《基因克隆的策略》ppt课件

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1、《基因工程概论》第一章导论第二章基因操作的工具酶第三章基因克隆的载体第四章基因克隆的策略第五章克隆基因的表达第六章基因工程的基本技术第四章基因克隆的策略引言第一节目的基因的获得第二节重组体的构建及细菌转化第三节重组克隆的筛选和鉴定引言基因克隆的本质是把某一目标DNA片段通过无性的方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目标DNA片段的获得；2、克隆载体的构建；3、寄主细胞的转化；4、重组体克隆的选择和鉴定。目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟，本章将以

2、这种克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析。大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案DNA片段的获得载体构建细菌转化重组体的鉴定限制性内切酶消化机械切割双链cDNA的合成化学法直接合成同聚物加尾粘性末端连接平末端连接加接头造成粘性末端重组噬菌体DNA转染重组质粒的转化体外包装进行转导表型鉴定核酸杂交免疫学分析酶切鉴定第四章基因克隆的策略引言第一节目的基因的获得第二节重组体的构建及细菌转化第三节重组克隆的筛选和鉴定第一节目的DNA片段的获得1、化学法直接合成基因2、从基因组文库中钓取目的基因3、从cDNA文库中钓取目的基因4、通过PCR直接扩增出

3、目的基因1、化学法直接合成基因所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。1977年，K.Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。早期通过化学合成的部分基因基因人胰岛素转运RNA-干扰素肠促胰液肽尿抑胃激素-干扰素大小（bp）12654281162453合成年代197819791981198219821984基因视紫红质前脑菲肽ATP酶溶菌酶RNA酶T1RNA酶Ａ大小（bp）10

4、5777170385324375合成年代198519851985198519861987磷酸二酯法寡核苷酸片段的合成首先，将一个5′端保护了的核苷酸和另一个3′端保护了的核苷酸通过缩合反应形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。为了定向形成5′-3′磷酸二酯键，通常用化学物质将不参加反应的基团保护起来。1、化学法直接合成基因反应结束后可以通过酸或碱的脱保护作用将保护基团去掉，这样一个5′保护了的合成的二核苷酸分子就又能和一个3′端保护了的单核苷酸分子进行第二次缩合反应形成一个三核苷酸的分子。如此反复进行缩合反应，就可以合成一条特定的寡核苷酸片段。基

5、因的组装过程通过化学合成的寡核苷酸片段只能达到150-200bp的长度，而一个基因的长度通常要大的多。所以必须通过一定的程序将寡核苷酸片段连接起来构建成一个完整的基因。这种将多个寡核苷酸片段装配成完整基因的过程称为基因的组装。基因组装常用的有两种方法：一种方法是先将寡核苷酸片段激活，带上5′磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，最后通过连接酶将这些寡核苷酸片段逐个连接起来成为完整的基因。第二种方法是将两条具有3′端互补的寡核苷酸单链进行退火，所产生的单链区段可在Klenow酶的聚合作用下很快得到互补的延伸，这样

6、就可以得到一段连接好的双链寡核苷酸片段，以此类推便可得到合成的基因片段。1、化学法直接合成基因基因的组装过程1、化学法直接合成基因方法1方法1ligaseKlenowfragmentsMCS第一节目的DNA片段的获得1、化学法直接合成2、从基因组文库中钓取3、从cDNA文库中钓取4、通过PCR直接扩增2、从基因组文库中钓取基因文库（genelibrary）是指汇集了某一生物基因组DNA全部序列的重组体DNA群体（转化子群）。基因组文库的大小（即应该包含多少个独立的克隆）与基因组本身的大小和克隆DNA片段的平均大小有关。基因组的大小（bp）2×106（

7、细菌）2×107（真菌）3×109（动物）理论数实际数理论数实际数理论数实际数克隆片段的平均大小（bp）5×10340018314000184186000002763110910×10320091920009208300000138155020×1031004581000460315000069077440×103502785002300750003543862、从基因组文库中钓取因为基因组DNA片段是随即克隆的，所以基因组大小除以克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值，从统计学的角度分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率只有50%。当克隆数

8、增加到这一理论值的2倍时，克隆到特定DNA片段的几率就上升到75%。所以为了达到一种合理的几率以克隆到目的基