《基因工程实验流程》ppt课件

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1、基因工程实验流程总览DNA提取，纯化限制图谱琼脂糖电泳检测片段体外扩增PCR目的基因制备载体选择DNA重组片段连接未知核酸序列须DNA片段大小估计互补性黏性不互补性黏性末端平末端限制性核酸内切酶酶切分离法简单基因组分离如质粒和病毒物理化学法构建基因组文库PCR扩增基因的化学合成双抗体免疫法酶促反应mRNA-cDNA目的基因分离双酶切部分酶切Bal31逐步切割转座子基因定位克隆酵母双杂交前处理防止自连RNA提取RT-PCRTA克隆蓝白选择胶回收表达引物PCR载体PCR产物回收转化感受态细胞构建基因组文库真核生物有成千上万个碱基对，单个未知

2、基因在整个基因组中的比例很小且不能在体外特异性扩增，所以只能对所有基因扩增，也就是构建基因组文库。油菜TOC33基因片的克隆实验项目背景国家自然科学基金项目（油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克隆，编号：30170500）。实验目的通过本综合实验，掌握植物基因组DNA的制备技术、PCR技术、限制性内切酶酶切技术、重组DNA技术、克隆鉴定技术、质粒DNA的制备、琼脂糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等，得到一个与科学研究过程相近的分子生物学综合技能训练。具体实验步骤Ⅰ.植物基因组DNA的制备Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增Ⅲ

3、.DNA的琼脂糖凝胶上回收与纯化IV.DNA片段的体外重组与转化V.克隆的筛选与鉴定VI.序列分析Ⅰ.植物基因组DNA的制备取0.2g样品嫩叶至1.5mLEP管中，放在液氮中冷冻处理后，在EP管中充分捣碎，加入0.6mL抽提缓冲液，65℃水浴处理10min。12,000rpm离心3min，取上清，加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀，遇有絮状沉淀，4,000rpm离心5min。沉淀用50ulTE-RNase（5.0mMTris.HClpH8.0，1.0mMEDTApH8.0，RNaseA30ug/mL）溶解，37℃保温处理15min。加入二倍

4、体积预冷的无水乙醇，-20℃下沉淀10min，4,000rpm离心3min，加适量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37℃烘干，加入50ulddH2O溶解备用。Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增引物设计，为扩增Toc33片段，用OLIG05.0设计1对PCR引物:上游引物P1:5'一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3'，下游引物P2：5'一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3'。在0.2mLEppendorf管内配制25ul反应体系：10×PCRBuffer2.5ulMg2+1.5uldNTP1.0ulPrimer1

5、1.0ulPrimer21.0ulTaq酶0.5ul模板1.0ulddH2O16.5ul1)94oC预变性5min2)      94oC变性30sec3)      55oC退火30sec4)      72oC延伸45sec5)重复步骤2)-4)30次6)      72oC延伸10min琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果1)称取0.5g琼脂糖放入溶胶瓶中，再加入1ml50×TAE缓冲液，49ml高水，置微波炉或水浴加热至完全融化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。2)取电泳槽里面的胶板，用胶带将两端封好，调平，并放好样品梳子。3)将冷到6

6、0oC左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入胶板，直至胶板上形成一层均匀的胶面。4)待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。5)用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。6)接通电泳槽和电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）；选择合适的电压，开始电泳；7)当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1－2cm处，停止电泳。8)将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色10min后取出，用清水冲洗。将胶放于凝胶成像系统内拍照，以观察样品在琼脂糖凝胶中的带（EB有剧毒，戴手套操作）。电泳染色后，在紫外分析仪上切取所需要的条

7、带，按1克胶：1000添加提取缓冲液，放在60度的金属浴中溶解。然后把溶液转移到试剂盒专用管中，6000转/分离心1分钟；倒掉上清，再加入500微升的extractionbuffer,12000r/min离心1分钟；倒掉上清，加入750微升的washbuffer,12000r/min离心1分钟；倒掉上清，重复步骤三；倒掉上清，在12000r/min下空转1分钟；把带有膜的管子换到新的EP管中，加入30~50微升的水，静置1分钟，12000r/min离心一分钟，即得到所要回收的片断。此样品可用来做酶切等。Ⅲ.琼脂糖凝胶上DNA的回收与纯化

8、IV.DNA片段的体外重组加试剂顺序由上到下（用500ul的EP管装），加完之后混匀，短时离心，用封口胶封口。将EP管放入金属浴当中37度酶切两个半小时左右，取出酶切产物，用试剂盒进行割胶回收进一步纯化酶切