《基因工程载体b》ppt课件

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1、第2节病毒(噬菌体)克隆载体本节主要内容λ噬菌体病毒载体Cosmid载体M13单链噬菌体病毒载体噬菌粒载体植物病毒载体CaMV(花椰菜花叶病病毒)克隆载体TMV(烟草花叶病毒)克隆载体动物病毒载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体（劳斯肉瘤病毒）腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体噬菌体：感染细菌的病毒病毒：一类超显微的非细胞生物,每一种病毒只含有一种核酸（DNA和RNA不会并存于同一病毒颗粒中）特点：只能在活细胞内营专性寄生;离体条件下,以无生命的化学大分子状态存在对抗生素不敏感，对干扰素敏感病毒与

2、宿主关系来分：温和性病毒构建载体的好材料烈性病毒通过改造，也可用于构建载体病毒克隆载体应用的局限性：温和性病毒和烈性病毒都存在严格的宿主专一性部分病毒的性质一.噬菌体T2噬菌体结构示意图三类典型形态的病毒：▼廿面体对称的结构(球状)▼螺旋对称的结构(杆状)▼复合对称的结构(蝌蚪状)大肠杆菌的T4噬菌体:由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成病毒中复合对称的代表噬菌体的生命周期分为:溶菌周期和溶源周期烈性噬菌体:只具有溶菌生长周期的噬菌体温和噬菌体:既能进入溶源生命周期又能进入溶菌周期的噬菌体溶源周期:感染过

3、程中无子代噬菌体颗粒,噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体DNA,细菌继续生长增殖,噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制烈性噬菌体的繁殖途径Phagereproductivecycle吸附Phageattachestobacterialcell.注入核酸PhageinjectsDNA.合成核酸和蛋白质PhageDNAdirectshostcelltomakemorephageDNAandproteinparts.装配Newphagesassemble.释放Celllysesandreleasesnewphages

4、.透明的不长菌的小圆斑典型的烈性噬菌体的生命周期20-60min温和噬菌体的繁殖途径溶原化途径溶菌途径λ溶源性细菌特点：超感染免疫性（抗御同种噬菌体再次感染的特性）溶源性细菌可诱发进入溶菌周期(OL、OR摆脱cI阻遏蛋白后进入该周期)☺cI=阻遏基因O=操纵基因P=启动子L=左向R=右向c、λ噬菌体在宿主体外与蛋白质结合包装成为含双链线状DNA的颗粒，分为四个区。λ噬菌体与λ噬菌体载体的特点：a、λ噬菌体是使用最早、研究最为详尽的大肠杆菌双链DNA噬菌体；1974年作为克隆载体使用。中等大小的温和噬菌体；常用于构建

5、基因组文库和cDNA文库；b、λ噬菌体载体克隆效率远高于质粒载体，获得的文库大而完整，构建的文库容易筛选、扩增和保存。线状λ噬菌体基因组的四个区：左侧区、中间区、右侧区（调控成分、复制基因O和P、溶菌基因S和R）和末端结构（λ噬菌体的DNA在噬菌体中是线状DNA分子，基因组是一长约48502bp的双链DNA）λ噬菌体cos位点由位于λ噬菌体线形双链DNA的两端且完全互补的粘末端（12bp）结合成的双链称为Cos位点att位点attLattR噬菌体插入大肠杆菌基因组方式Champbell模型λ噬菌体DNA环化的λ噬菌

6、体DNAIntegrase催化链的交换包装限制：离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中以形成有功能的病毒载体；λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力:上限：野生型DNA总量（48kb）的5％左右低限：野生型DNA总量（48kb）的75％构建λ噬菌体的基本策略与技术路线：(1)去除λ噬菌体非必须区方法：去除非必须片断(复制、裂解等非必须)同时，抹去一些酶切位点λ噬菌体的包装限制:大小51-36kb之间溶菌途径：λ噬菌体感染Ecoli后，线形λDNA注入细胞内，若进入溶菌生长途径，则粘性末端连接成环状DNA分

7、子，指令宿主细胞合成与包装相关的系列壳蛋白和酶，复制出新的λDNA，包装成子代噬菌体颗粒，并在R蛋白和S蛋白的作用下，宿主细胞破裂，释放出大量子代噬菌体颗粒，感染新的细胞。依靠cos位点形成环状的λ噬菌体DNA代表性λ噬菌体载体插入型载体(insertionvectors)：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点（只能承受10kb以内的小片段外源DNA的插入，广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆）置换型载体(replacementvectors)：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DN

8、A片段所取代（可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，适用于克隆高等真核生物的染色体DNA）置换型插入型插入失活效应：外源的DNA克隆进入插入型的λ载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力。免疫功能失活的（inactivatiortofimmunityfunction）和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlonofE．coliβ-galac