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1、制曲过程中微生物菌种筛选与性能鉴定指导老师：学生姓名：学号：大曲是白酒生产过程中的糖化剂、发酵剂，是白酒发酵生产中微生物及酶的主要来源，大曲的质量直接关系到酒的出酒率及基酒的质量。1研究或解决的问题本课题拟从不同时间段的大曲样品中分离获得各类微生物，对各类微生物进行计数；根据各类微生物特定的菌落形态进行分离，同时对菌种进行筛选；分析大曲微生物在不同时间段种类的变化和微生物数量的变化；在传统微生物鉴定方法的基础上，采用BIOLOG自动微生物鉴定仪来进行微生物的性能鉴定，通过比较两者的优劣来确定对微生物性能鉴定的最有
2、效的方法；同时在分离和纯化过程中探讨如何更好地培养微生物。2实验材料与方法2.1材料跟踪取样的单粮型大曲（纯小麦）2.2实验仪器与设备高压灭菌锅、超净工作台、电热恒温培养箱、振荡器、电子天平、酸度计、电磁炉、温度计、冰箱、恒温水浴锅、移液管（5mL，1mL）、试管、烧杯、玻璃棒、吸耳裘、无菌培养皿、涂布器、接种环、250mL锥形瓶、5mL刻度吸管、1mL刻度吸管、BIOLOG自动微生物鉴定仪。2.3培养基及试剂牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、孟加拉红培养基、BIOLOG自动微生物鉴定仪的特定培养基。2.4实验步
3、骤2.4.1操作流程培养基配制→灭菌→取样→样品悬浮液配制→接种→分离和纯化→菌种筛选→接种→鉴定2.4.2操作要点（1）培养基的配置根据培养基配制的要求进行。（2）灭菌在实验过程中所有的器皿和相关设备要进行高温杀菌。同时在实验进行时，要在无菌状态下进行。（3）根据制作大曲的生产周期，跟踪取样8次，每次取大曲表层和曲心的混合样，每次取二个样品（不同库房内取一次），成型入库前取未湿润的原料一次和湿润的原料一次。（4）浮液配制无菌条件下，取5g样品，加入50mL无菌水，充分摇匀，自然沉淀后取上清液，得到10-1稀释样
4、。然后依次制成10-2-10-7稀释样。（5）分离酵母菌的分离将增殖培养液作适当稀释，取0.5mL注入培养基琼脂平皿上，用玻棒均匀涂布，于30℃培养48h，根据菌落特征及镜检确认为酵母菌后，挑取单菌落，平板划线法纯化，纯菌株移入斜面，备用。细菌的分离将增殖培养液作适当稀释，取0.5mL注入培养基琼脂平皿上，用玻棒均匀涂布，于37℃培养2～3d，根据菌落特征及镜检确认为细菌后，挑取单菌落，平板划线法纯化，纯菌株移入斜面，备用。霉菌的分离分离同酵母的分离一样（6）BIOLOG微生物鉴定操作步骤①微生物的纯培养用于鉴定
5、的微生物必须为纯培养物,可将菌种分离纯化获得单菌落,使用菌落放大灯观察菌落形态判断是否为纯培养物。②富集培养微生物富集培养必须用BIOLOG专用培养基BUY培养基③菌悬液制备（a）取无菌棉签在接种液中蘸湿。（b）将棉签在菌落表面滚动,粘取菌体,注意不要带出培养基。（c）在接种液管液面上沿内壁转动棉签,使菌体附着在内壁上,同时将菌体均匀打散。（d）倾斜接种液管,用棉签将菌体分散于接种液中。如果有小的菌团,应使之沉到管底。④调整浊度(a)关闭浊度计电源,调整指针至“0”刻度;(b)用吸水纸擦干净空白接种液管外壁,置于
6、浊度计中,接通电源,调整指针至100%T；(c)使用YT浊度标准品检查浊度仪的准确性,并调整至47%T；(d)擦干菌悬液管外壁,插入浊度计,读取菌悬液浊度值；(e)通过添加菌体或空白接种液调整浊度值,使其在相应标准浊度值的±3%范围内。⑤微平板的接种与培养（a）微平板的接种将制备好的菌悬液倒入加样槽中,使用八道电动移液器,将其接种于微平板的96孔中。（b）微平板的培养盖上微平板盖,标上菌株编号,放置于大小适宜的托盘中,保持一定的湿度,可将1块湿毛巾垫于托盘底部来保持湿度。2.5实验结果2.5.1制曲过程大曲温度变
7、化动态记录每天的气温和每个取样库房里面的温度，观察温度的变化趋势。2.5.2制曲过程中细菌类的数量变化采用平板菌落计数的方法：将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液接种到平板上,经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。计数步骤：编号→稀释→取样→倒平板→计数①编号取无菌平皿和盛有无菌水的试管，对其进行编号②稀释用1ml无菌吸管吸取1ml已经充分混合均匀的菌悬液，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此为10倍稀释。依次稀释，
8、得到不同梯度的菌悬液。③取样用无菌吸管吸取菌悬液，对号放入编号的无菌平皿中。④计数培养一段时间后，取出培养平板，算出同一稀释度上菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度重复的平均菌落数×稀释倍数×52.5.3大曲理化指标随取样天数的变化2.5.3.1水分的测定（1）测定方法采用烘箱干燥法，准确称取试样10g,放入事先烘干、恒重的60—8
