《酶切回收连接》ppt课件

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1、基因工程的基本过程分切接转筛表质粒DNA的酶切定义：识别dsDNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶Ⅱ类内切酶作用特点能在特殊位点识别和切断dsDNA，识别序列4-6bp，具有回文结构（180度旋转对称结构）HindⅢ产生5'粘性末端AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAASstⅠGAGCTCCTCGAG产生3'粘性末端GAGCTCCTCGAG粘端切口GTCCAGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的

2、种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。3、命名：HindⅢHaemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶属系株序书写方法：前3个字母斜体酶活性单位指在限定条件下（温度、Buffer），1hr消化1ugDNA的酶量称为一个酶单位（unit）。实际工作中，为保证消化完全，1ugDNA的消化需要3-5个单位的酶，反应时间也要适度延长，通常是反应过夜。酶切反应系统的设计回收DNA通常酶切10μg实际酶的用量应是理论用量的3-5倍。酶通常保存在50%的甘油中，使用时甘油浓度必须小于5%，故酶至少稀释

3、10倍。Buffer通常是10×，使用时稀释10倍。总反应体积20-50ul，不足用tdH2O补足。DNA的量酶的用量（U/C）酶在50％甘油中，甘油在总体积的浓度要小于5％反应的总体积Buffer的体积水的体积质粒DNA15μl（10μg）HindIII(20U/μl)1.5μl10×缓冲液E3μl三蒸水9μl_____________________________________总体积30μlXbaI（20U/μl1.5μl加样顺序加样后混匀，短暂离心，使之至管底。DNA片段的分离纯化四、操作步骤：关键操作：点样在加样孔正上方，不

4、要进入孔中甚至戳穿孔底加样器一旦按下，就一定保持按住直至加样器离开加样孔，否则会将样品又吸回到tip中，使加样失败载体DNA目的基因bp—1534—994—695—515—377—237ABCM酚抽提法切下含目的DNA的胶块。加入酚，将胶块没过即可。振荡后低温冻结，视温度而定时间。30℃水浴融化，若体积小，可补加TE。振荡器上振荡。12,000rpm离心5min。取上清200μl。用200μl的氯仿：异戊醇抽提（振荡，离心12000rpm，5min，取上清）。加20μlNaAc，400μl无水乙醇沉淀DNA，冰冻约30min甚至过夜。12

5、,000rpm离心10min，弃上清。将DNA溶于约30μlTE中。DNA片段的连接反应DNA连接酶ligase催化DNA5'磷酸基与3'羟基之间形成磷酸二酯键(ATP)5'5'3'3'OHPOHPDNA连接酶DNA连接酶总体积20μl载体0.1~0.2μg目的基因：载体mol数=1～5：1H2O10×buffer载体目的基因ligase总体积20μlμlμlμlμlμl连接应注意的事项：目的基因与载体的mol数之比连接酶的buffer：溶解充分，分装，防止ATP降解温度：4~8℃最好。