板种细胞问题(不均匀)

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1、细胞不均匀的问题原因：1.培养液量少，由于瓶体内液体有向边缘吸的特性，所以造成中间低洼，细胞容易聚集，建议多加液体2.接种后不要摇晃，传统的思想认为摇一摇能使细胞均匀，但是事实上在摇晃的时候由于剪应力等多种因素的影响，细胞反而分布不均。解决方案：1)接种到培养瓶的细胞，轻轻地让细胞悬液流遍整个瓶底；2)接种到培养皿或者培养板的细胞，用枪头对准中央加，让细胞悬液自行流遍整个孔，若有少量区域未能覆盖到细胞悬液，可用枪头轻轻牵引悬液，千万不要摇。细胞悬液铺满后，不宜立刻放入孵箱中，我一般静置>15min，这样接种的细胞很均匀。3)培养皿划“十”字交叉轻轻混匀（力度不易太大，否则剪切力损伤

2、细胞），重复一次。轻轻放入孵箱即可。（1）平底和圆底（U型和V型）培养板的区别和选择：贴壁细胞一般用平底培养板。悬浮型细胞的培养一般用V型。U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞。V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。（2）细胞培养常见问题与解答问：我看到培养板有4、6、12、24、48、96孔几种规格，但不知道到底什么实验用哪种规格。答：要根据你具体的实验要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，细胞爬片一般用24孔等，要具体根据你实验来定。问：我想测吸光度用酶标仪，用多孔细胞培养板行吗？请问酶标板多孔细胞培养板有什么区别？答：用多孔细胞培养板测吸光度肯定可以拉，我们经常用它来做样品的

3、蛋白定量和MTT检测。区别：酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，但也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不能用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测，它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2-3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。（3）细胞培养板的密闭和污染问题问：96，24孔培养板或培养皿的盖子都很松，这样是方便了透气，但是细菌、霉菌等

4、污染物会不会也随着溜进去呢？答：1.盖子很松，属于半开放培养，这样的目的是透气（实际上是为了使培养皿外的co2能够与培养皿充分交换，维持培养基的pH值）。2.凡事有利必有弊，这样当然增加了污染的可能性。此外这样还会使培养皿内的液体蒸发，这对于精确定量的药物来说就显得值得注意了。所以以下二条措施是必须的a培养箱内空气必须清洁（定期紫外线照，酒精擦洗，尽量少开关培养箱）b培养箱内的湿度必须始终保持为100%（培养箱内放置无菌蒸馏水的水槽）。就好像培养皿，也是一个盖倒扣的容器，也不会污染。主要是因为盖子“L”型边缘产生气流负压的缘故，灰尘上面才附着有微生物，而气流携带的灰尘是无法通过产生

5、负压的盖边缘的。而透气作用只是通过空气的扩散，不会产生气流，所以只会透气不会透菌。问：我使用24孔板，在其中的某些孔中有操作（在超净台内），而其它孔中还有细胞要培养.我很担心这样会污染，不知道要注意什么?在超净台内如果操作规范的话应该可以的，我想你可以充分利用培养版的盖子，尽量只暴露要操作的孔，将其它孔用盖子盖起来。这是我的一点粗浅的见解，抛砖引玉吧！使用前综合考虑一下，充分使用所以的孔；如果只需要使用少数的孔可以只用一边的，其余用盖子盖住，我习惯于先用右侧的孔（右手加样方便）。其实自己感觉只要注意无菌操作，一般是不会污染的。操作时用几块玻片把板子一侧垫高，不要把盖子全打开，一般没

6、问题。（4）细胞分布不均及解决办法问：我的细胞接种培养板，细胞总是聚集在周边部分，该如何处理啊？我看园子里有的战友的细胞却是聚集在中间，是不是板子的质量问题啊？答：请问你的细胞是如何混匀的？是滴管吹打还是振荡培养板？如果是后者，而且是转圈摇匀的话，很有可能由于离心力的作用使细胞甩到周边部分，导致细胞中间少，四周多！自己可是试试！周边一般是相对会多一点，但是中间的数量也不会很少啊~~铺板的时候我也没有特异去振荡培养板。大概是板子的质量问题吧或者是不是铺板时候的细胞密度太低了？我用的corning的板。一个好办法：在你培养种板之前，把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和后再取出，种入细

7、胞时力量要轻，可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让细胞悬液流入板孔中，培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振荡，否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。我今天把培养板放入培养箱里几个小时，适当的把细胞密度加大了一下，另外多加了一点培养液，今晚看细胞铺的挺好的。我认为有两种可能解决你问题的办法:1.加入前吹打均匀;2.从多孔板侧边或底边缓慢加入。问：我在做原代培养时也遇到过这种情况，我一直以为培养皿铺胶不均匀会导致这种现象，因为混匀的血管段加入到培养皿中时，