第十四章 第二次课

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1、基因信息的传递第三篇授课教师：李晓坤生物化学与分子生物学教研室邮箱：lixiaokun0026@163.com电话：15836103539生物化学1GeneticRecombination&GeneticEngineering基因重组与基因工程第十四章2第一节：DNA的重组第二节：重组DNA技术第三节：重组DNA技术与医学的关系本章主要内容3回顾：DNA的重组：重组DNA技术相关概念：同源重组：最基本细菌的重组：接合、转化、转导、细胞融合特异位点重组：整合酶转座重组：插入序列、转座子DNA克隆工具酶：限制性内切酶目的基

2、因基因载体4二、重组DNA技术的基本原理与操作基本原理(基本过程)：目的基因的获取DNA导入受体菌目的基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选目的基因的表达5SS基因基因载体重组体分切接转筛表SS6以质粒为载体的DNA克隆过程7（一）目的基因的获取1.化学合成法2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)8DNA合成仪已知核苷酸序列目的DNA（合成的片段较小）1.化学合成法获取目的基

3、因：91.化学合成法获取目的基因：由已知产物的氨基酸序列可以推测出基因可能的DNA序列。小分子活性多肽基因的合成，如：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及干扰素基因等。10基因组DNA文库：存在于转化细胞内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。2.从基因组DNA文库获取目的基因：组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌11限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反

4、应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因组文库图14－11用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库123.从cDNA文库获取目的基因：逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ酶/碱水解TTTT组织或培养细胞mRNAcDNA载体cDNA与载体DNA连接导入大肠杆菌鉴定cDNA文库的克隆数与特性13DNA利用了DNA的变性和复制的机制：加热退火、延伸单链DNA复制的DNA双链引物、dNTP聚合酶PCR（polymerasechainreact

5、ion）:即聚合酶链反应技术，是一种在体外利用酶促反应快速扩增特定核酸片段的技术。4.聚合酶链反应(PCR)获取目的基因：14PCR测序反应示意图变性(95℃)引物连接(Tm－5℃)半保留复制(72℃)反复循环15PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增聚合酶链反应（PCR）16目的基因克隆载体重组体（二）克隆载体的选择和构建克隆载体：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。选择和构建合适的载体是基因工程成功的关键步骤。载体的选择

6、和构建要根据基因工程的目的。目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改进方法也不同。17（三）外源基因与载体的连接将目的基因或序列插入载体（即DNA的体外重组），主要靠DNA连接酶。连接方式：1.粘性末端的连接2.平端连接3.同聚物加尾连接4.人工接头连接18条件：末端碱基序列互补1.粘性末端连接：方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接（三）外源基因与载体的连接19BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用Ba

7、mHⅠ切割DNA连接酶15ºC重组体同一限制酶切位点连接：20不同限制酶切位点(配伍末端)的连接：配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。MboⅠ切割位点GATCCTAGBamHⅠ切割位点GGATCCCCTAGGCTAGGATCCGGATCCCTAGG21不同限制酶切位点(非配伍末端)的连接：EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切DNA连接酶15ºC重组体连接方向一定22限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：2.平端连接：23目的基因载体限制性

8、内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连平端连接24在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。3.同聚物加尾连接：利用同聚物序列，比如多聚A与多聚T之间在退火作用下完成连接。属于粘性末端连接的一种特殊形式。这是人工提高