2、菌种的来源

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1、2、菌种的来源选择性分离原理与方法2、菌种的来源2.1生物物质产生菌的筛选2.1.l微生物－－生物产物的来源微生物现在和将来都是具有各种生物活性的新产物的丰富资源。这一章的目的是要研究如何才能筛选到具有所需生物特性的新产物。除了初级代谢产物，如氨基酸和维生素外，微生物还用于生产许多次级代谢产物。筛选这类产物的两个成功要素在于：1）产生菌的选择；2）采用什么样的筛选方案（检测系统）。选择筛选方法有两个要点即选择性和灵敏度。2.1.2待筛选样品的性质（液体、固体培养基）2.l.3筛选方案的设计基本上可利

2、用以下三种不同的筛选方法1）整体生物；2）完整细胞；3）亚细胞制剂。2.2微生物选择性分离的原理和发展在过去40年间曾筛选出许多产生新的有用的次级代谢物的菌种。这些菌种多半是以经验式的筛选方法获得的。大多数的抗生素均由放线菌纲产生。下面介绍放线菌纲为主的分离方法原理和发展。选择性分离方法大致可分为五个步骤：含微生物材料的选择；材料的预处理；所需菌种的分离；培养；菌落的选择和纯化。以上任何一个阶段都可引入选择压力。2.2.1含微生物材料的选择在选择菌种来源时，存在一些选择标准。对于天然材料，如土壤的选

3、择，来源越是广泛的样品越有可能获得新的菌种；另一方面，可寻找已适应相当苛刻的环境压力的微生物类群。我们对海洋微生物类群的知识仍有限。在富盐环境中存在着一类尚待开发的放线菌。在酸性土壤圈的放线菌类群与其紧接下层的中性圈的有很大的不同。利用同一生态环境内的不同环境条件分离出更多种类的菌株。自然环境的菌群可因人类的活动而改变。更新的生态环境有待开发。迄今，仍很少人从厌氧微生物中筛选次级代谢产物。2.2.2材料的预处理为了提高分离效率，设计了各种处理材料的方法。通常采用热处理方法减少材料中的细菌数，这种作用

4、的基础仍不清楚，但许多放线菌的繁殖体，孢子（如链霉菌）和菌丝片段（如红球菌）比G（－）细菌细胞耐热。加热虽然能减少细菌同放线菌的比例，但也常减少放线菌的数目。通常采用膜过滤法浓缩水中的细胞。然后将滤膜置于培养基的表面，放置几个小时后移去，或一直留在上面。滤膜的品种对收集菌的类型有重要的影响，如处理放线菌繁殖体含量很低的海水，有人先将样品离心然后才过滤。收集在腐烂的稻草和其它植物材料中的嗜热放线菌孢子可在空气搅动下进行。并可用－风筒或一简单的沉淀室收集孢子。然后，用Anderson取样器将空气撞击在培

5、养基的平板上。这样可以减少分离平板中的细菌数目。也有在分离前添加一些固体基质（如把几种基质加在土壤中）或洒些可溶性养分来强化培养基、所谓诱饵技术是将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。有人曾广泛使用石腊棒技术来分离诺卡氏菌，和从土壤中分离耐酸放线菌，游动放线菌科的某些属产生游动的孢子。并且曾用各种诱饵法来分离它们。近来，用花粉诱饵从土壤中分离出13株小瓶菌，其中有些新种或亚种。2.2.3所需菌种的分离分离的效率取决于培养基其养分，pH和加入的选择性抑制剂。表2－3列举了分离放线菌的

6、各种培养基配方。一般凭经验而不是绝对性选择。其中广泛应用的三种培养基（其成分完全不同）即几丁质琼脂，淀粉－酪素培养基和M3培养基。因大多数放线菌都是嗜中性的，分离培养基的pH常在6.7－7.5之间。如要分离嗜酸放线菌，pH宜降低到4.5－5.0。有人从碱性的加拿大土壤中分离出嗜碱链霉菌，它不能生长在低于pH6.1－6.8的条件下。估计嗜碱性放线菌也可能存在于其它碱性环境中。在分离培养基中广泛采用加入抗生素的方法，来增加选择性见表2－4。在筛选放线菌时，可加入抗真菌抗生素。这种抗生素对放线菌无作用。2

7、.2.4菌种的培养放线菌分离平板通常在25－30℃培养。嗜热菌在45－55℃，而嗜冷菌在4－10℃。主要的变量是培养的时间。分离嗜温菌如链霉菌和小单孢菌一般培养7－14天。嗜热菌，如高温放线菌只需l－2天。除非延长培养时间，有可能漏掉新的或不寻常的菌株。因此，有人在30℃和40℃将培养时间延长到1个月，结果分离出一些不寻常的种属。也有人在20℃培养6周从海水中获得放线菌。2.2.5菌落的选择应采用什么方法取决于筛选的最终目的。常用以下两种筛选方法：（l）铺菌法于分离平板上铺上一层单一的试验菌的办法可

8、用来测定各个菌落的抗生素生产能力。（2）复印平板法将菌落复印在平板上的办法来研究它们对一系列试验菌的作用。这两种方法都有缺点。铺菌法会使所需要的菌落污染，并且只能在每个平板上铺上一种试验菌。菌落复印平板法对不长孢子的链霉菌则不能使用，也不适用于游动细菌的筛选。因而，需要设计一种更为有效的筛选新菌种的方法。2.2.6未来的发展近来发展了一种更为理性化的微生物筛选技术，现已到实用阶段。采用遗传或生理操纵的办法有可能发现新的代谢物或提高现有分离株的生产能力。A天然基质的选择