酶联免疫反应

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1、酶联免疫反应概述免疫分析：是以抗原抗体相互结合的免疫反应为基础，研究免疫学技术及其在医学领域中的应用。免疫分析的分类根据分析过程中是否需要标记物可分为两类一、标记免疫分析：根据标记物的种类可分为1、酶免疫分析2、放射免疫分析3、发光免疫分析4、荧光免疫分析5、金（银）免疫标记分析二、非标记免疫分析：免疫沉淀实验、免疫浊度分析技术一、酶免疫分析：是利用酶的高效催化和放大作用与特异性免疫反应结合而建立的一种标记免疫技术。原理：用酶标记的抗原（或抗体）用于免疫反应，并以相应的底物被酶分解的显色反应对样品中的

2、抗体（或抗原）进行定位的分析和鉴定。根据是否需要分离结合与游离的酶标记物可分为可分为非均相(或异相)酶免疫测定和均相酶免疫测定两种方法。均相酶免疫分析法（homogeneousenzymeimmunoassay，HEI）是在检测过程中抗原抗体反应后，无需分离结合和游离酶标记物，直接根据反应前后酶活性的改变进行待测物质的测定的分析方法。均相酶免疫分析主要有酶扩大免疫测定技术和克隆酶供体免疫测定两种方法。均相酶免测定的对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物测定。可以直接用于全自动生化分析仪测定。非均相酶免

3、疫分析法（heterogeneousenzymeimmunoassay）常用的酶免疫分析法多为非均相法，又可分为液相酶免疫法和固相酶免疫法两种，以后者最常用，称为酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）。ELISA是临床上最常用的免疫分析方法。需经过结合的标记物和游离的标记物的分离才能测定.分离的方法主要通过固相载体吸附后清洗未结合的游离标记物。ELISA既可以测定抗原，也可以测定抗体。根据测定对象不同，可采用不同的模式，主要有双抗夹心法、间接法和竞

4、争法等。一、ELISA简介二、ELISA原理三、ELISA分类四、ELISA相关试剂五、ELISA影响因素六、ELISA应用一、ELISA简介1971年瑞典学者Engvall和Perlmann，荷兰学者VanWeeman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，ELISA）。自上世纪70年代初问世以来，ELISA发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。二、ELI

5、SA原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。YY①固相的抗原或抗体（免疫吸附

6、剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）加样本微量反应孔包被好的抗体振荡、洗板待测项目（抗原）加入酶标记得抗原VV酶标记物轻链螯合剂辣根过氧化物酶重链振荡、洗板V加入底物显色液免疫标记技术放射物标记技术酶标技术免疫荧光技术其他标记技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法竞争法双抗原夹心法间接法三、ELISA分类双抗体夹心法竞争法间接法ELISA基本实验过程包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原

7、或抗体发生免疫反应而被结合固定酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色实验中对照的设置阳性对照阴性对照空白对照临界标准品ELISA试剂（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液。固相抗原或抗体1、固相载体的性状固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。ELISA载体

8、的形状主要有：膜（NC膜、PVDF膜、尼龙膜）、微量滴定板（96孔板）、小珠和小试管，以微量滴定板（96孔板）最为常用。良好的ELISA用96孔板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。2、包被用抗原用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。3、包被条件酶标记的抗原或抗体（结合物）1、酶用于ELISA的酶应符合以下要求：（1）纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富