picbio 三代测序原理

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1、三代测序之PacBioSMRT技术全解析2017-05-1111:29来源:基因谷技术原标题：三代测序之PacBioSMRT技术全解析气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。今天小编要来和你分享：PacBioSMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展，PacificBiosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBioSMRT测序平台。PacBioSMRT测序原理

2、PacificBiosciences公司研发的单分子实时测序系统（SingleMoleculeRealTime，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同

3、时持续进行PacBioSMRT测序原理PacBioSMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-modewaveguides,ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinkednucleotides）。SMRTCell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只

4、有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅地降低了背景荧光干扰。SMRTCell和ZMWs将荧光染料标记在核苷酸的磷酸链而不是碱基上，当核苷酸掺入到新生的链中，标记基团就会自动脱落，减少了DNA合成的空间位阻，维持DNA链连续合成，延长了测序读长。SMRT测序最大限度地保持了聚合酶的活性，是最接近天然状态的聚合酶反应体系。荧光标记在焦磷酸链上的核苷酸PacBioSMRT测序送样要求PacBioSMRT测序建库流程DNA打断之后，经过末端修复、接头连接、片段筛选、杂交测序引物和聚合酶绑定，即可出库准备上机测序，建库过程

5、无PCR反应。PacBioSMRT建库流程PacBioSMRT技术特点PacBioSMRT技术有两种测序平台，RSⅡ和Sequel，应该如何选择？小编已将二者的对比表准备好啦~表3RSⅡ和Sequel测序平台比较Sequel平台与RSII平台相比具有很大的优势，Sequel平台测序通量高、单Gb数据成本低、周期短。1.第三代基因测序技术又被为"SingleMoleculeRealTime(SMRT™)DNASequencing"（单分子实时DNA测序技术），该方法基于纳米孔的单分子读取技术，不需要扩增即可快速读取序列。目前，Paci

6、ficBiosciences公司已经成功推出了商业化的第三代测序仪PacBioRS平台，使得第三代测序正式走入人们的视角。PacBioRSII是PacificBiosciences公司研发的单分子实时测序系统（SingleMoleculeRealTime,SMRT），其专利的SMRTCell含有15,000个纳米级的零模波导孔（zero-modewaveguides,ZMWs），每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。2.2 技术特点ü  利用测序过程聚合酶反应的动力学变化

7、，首次实现对碱基修饰进行直接测序。ü  超长的读长：平均测序读长能达到7,000-8,000bp，最长读长能达到3,0000bp；ü  准确率高：对基因组组装和基因组变异检测，可以最多达到99.999%的准确率；ü  敏感性强：可以检测频率在0.1%的minorvariants；ü  无PCR扩增偏好性：样本不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一和PCRartifacts；ü  最小的GC偏好性（GCbias）：在极端高GC和极端低GC区域，可以轻松测定，从而保证序列的均匀覆盖度。1.3数据产出试剂盒           平均读长

8、   数据量/SMRTCellP4-C2Chemistry  5.5-6Kb    ~200MbP5-C3Chemistry  8-10Kb    ~250Mb2.4应用领域（1）全基因组denovo测序与二代测序最高不超过1kb的读