HPLC方法开发基础知识

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1、HPLC方法开发基础知识周瑾2015.10.25色谱定义色谱又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。色谱分类按固定相分类柱色谱、纸色谱、薄层色谱按流动相分类气相色谱高效液相色谱：正相、反相超临界流体色谱离子色谱电色谱高效液相色谱分析方法（HPLC）的基本参数色谱柱：C8、C18、HILIC、手性柱等流动相：有机相、缓冲液添加剂柱温

2、：根据色谱柱类型，可能有不同要求进样量：根据要求，可能为5~100μl流速：一般为0.8~1.5ml/min波长：需要根据化合物特性确定样品浓度：需要根据化合物特性及分析目的确定好的HPLC分析方法是什么样的能达到预期的分析目标稳定的能经过方法学验证的简单易操作的系统适用性系统适用性是检测仪器系统是否满足分析方法满足要求的性能指标，一般有以下几项要求：空白无干扰理论塔板数拖尾因子分离度灵敏度（信噪比）进样精密度HPLC分析方法的类型含量检测含量溶出单一或个别杂质检测杂质/

3、有关物质检测方法开发的首要目标根据系统适用性的要求，分析方法开发的首要目标如下，这是准确定量的基础。峰形（理论塔板数、拖尾因子）分离度保留时间、峰面积重现性其他验证项目HPLC分析方法基本的评价指标（方法验证项目）专属性：空白干扰、分离度精密度：进样精密度、重复性、中间精密度线性及范围检测限和定量限准确度溶液稳定性耐用性对几个问题的讨论1.什么情况下需要验证分析方法的定量限？2.系统适用性需要验证吗？3.专属性如果不好怎么办？精密度呢？回收率呢？耐用性呢？4.如果精密度不能通过验证，可能

4、是什么原因？回收率呢？溶解性溶解性为待测物质在溶剂中的溶解能力。不同的晶型可能有不同的溶解性，同一个物质在不同的溶剂中有不同的溶解性。Q：溶解性会影响色谱行为的那些方面？质子性溶剂、非质子性溶剂质子性溶剂是指能提供质子的溶剂，如水、醇类非质子性溶剂是指不能提供质子的溶剂，如乙腈、二甲基亚砜、乙酸乙酯等。质子性溶剂化学活性一般较非质子性溶剂高。Q：溶剂类型可能影响哪些色谱行为？稳定性在HPLC中，稳定性分为两种，一种为化合物本身的稳定性，另一种为化合物在溶剂中的稳定性。当化合物本身不稳定时，其溶液一般也不会

5、稳定，分析时就需要现配现进。有时候，如果知道化合物的降解途径，可以有针对性的抑制其降解。比如化合物易被氧化时，可以在溶液中添加维C，防止其被氧化。化合物在溶液状态时，由于分子间的运动，其稳定性降低。由于很多物质其化学活性受到质子的影响，因此在有质子的环境下，可能会降解，会降解速率加快。因此可以采取的措施就是使用非质子性溶剂。另外，如果使用了溶解性能不好的溶剂，溶液在存放过程中可能会析出，也会造成溶液不稳定。极性极性指一根共价键或一个共价分子中电荷分布的不均匀性。如果电荷分布得不均匀，则称该键或分子为极性；如

6、果均匀，则称为非极性。物质的一些物理性质（如溶解性、熔沸点等）与分子的极性相关。在RP-HPLC（反相）色谱中，由于固定相为非极性（小极性），流动相为极性，所以一般极性大的物质先流出，保留若；极性小的物质后流出，保留强。酸、碱、pKa解离常数(pKa)是水溶液中具有一定离解度的溶质的的极性参数。离解常数给予分子的酸性或碱性以定量的量度，Ka增大，对于质子给予体来说，其酸性增加；Ka减小,对于质子接受体来说，其碱性增加。pKa是Ka的负对数。Ka越大，pKa越小。在HPLC中，当流动相的pH在待测物的p

7、Ka±2之外时，待测物在流动相中绝大部分以一种形态存在，就能得到稳定的保留和峰面积。对于酸性物质来说，当流动相pH减小时，其保留增加，反之则减小；对于碱性物质来说，其保留行为和酸性物质相反。流动相添加剂、缓冲液HPLC分析某些物质时，需要特定的pH值的流动相，仅仅使用水及有机相时，是不能达到要求的。这时候可以在水相或有机相中添加某些化学试剂，从而达到目的。某些时候，不同的流动相添加剂具有不同的保留行为（选择性），筛选多种流动相添加剂有可能使分离度更好。使用流动相添加剂时需要注意以下几点：添加剂的紫外吸收与

8、分析方法的波长是否匹配流动相的pH是否在添加剂的缓冲范围内对于质谱联用的分析方法，还需要确保添加剂具有挥发性添加剂应不会对色谱柱造成损伤。流动相添加剂、缓冲液有时候，流动相添加剂还能抑制某些待测物与固定相/流动相间的物理化学作用，从而使峰形更尖锐对称。比如三乙胺，可以有效抑制碱性化合物和色谱柱固定相上键合的醇羟基，从而抑制二次保留，获得对称的峰形。流动相添加剂、缓冲液缓冲液名称及常用浓度缓冲p