转基因成分PCR定性检测技术

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1、种子转基因成分PCR定性检测技术种子转基因成分PCR定性检测技术将不同来源的DNA分子进行重组，克服了天然物种生殖隔离的屏障，将具有某种特性的基因分离和克隆，再转接到另外的生物细胞内。转基因可以按照人们的意愿使生物体的遗传性状发生改变，创造出自然界中原来并不存在的新的生物功能和类型。是指遗传物质基因被改变的生物，其基因改变的方式是通过转基因技术，而不是以自然增殖或自然重组的方式产生。简称：GMOs非转基因油菜喷施草甘膦前抗草甘膦油菜RT73喷施草甘膦后返回中国培育的转基因抗虫水稻Bt63v植物转基因方法花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利

2、用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于20世纪80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。转入的基因调控元件：启动子、终止子、内含子、增强子等；标记基因：hpt基因，NptII基因，GUS基因等；目的基因：抗虫性状的cry系列基因、抗除草剂性状的EPSPS基因、PAT基因、BAR基因等。P35STerminatorMon810玉米IntronHSP-CryAbP35STerminator其

3、他Bt玉米转基因作物的研究最早始于20世纪八十年代，1983年全球第一例转基因植物在美国问世，1987被允许进入田间鉴定试验，1992年开始大田产量试验，1995年完成安全性评价研究，1996年在美国最早开始商业化生产，当年种植面积174万公顷。据“农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）”2011年3月7日发布的年度报告称：2010年，共有29个国家种植了1.48亿公顷转基因作物；1996年到2010年，全球转基因作物累计种植面积超过10亿公顷。2010年中国种植转基因作物面积达350万公顷，排名世界第六，其中转基因棉花330万公顷，其余是转基因木瓜，转

4、基因番茄，转基因辣椒等。截止目前，中国共批准发放7种转基因植物的农业转基因生物安全证书，耐贮存番茄、抗虫棉花、改变花色的牵牛花、抗病的辣椒、抗病的番木瓜、抗虫水稻、转植酸酶基因玉米。v转基因检测方法分类生物化学测定法蛋白质分析法v转基因成分PCR定性检测DNA提取PCR扩增v转基因检测方法分类1.掌握检测对象的基本信息。如DNA或蛋白水平检测，要了解转基因植物插入的DNA序列信息及表达情况；2.须有针对特定核酸或蛋白的检测方法。如DNA水平检测的引物、探针和蛋白水平检测的抗体等；3.检测必须使用标准参考物质。作为转基因成分检测中的对照、用于制作转基因定量分析

5、的标准曲线、不同实验室之间结果比较的重要参考。转基因检测工作流程样品DNA提取PCR扩增电泳分析阳性阴性检出GMO成分未检出GMO成分检测步骤vDNA提取vPCR扩增v电泳分析vDNA提取vPCR扩增1、引物：用TE缓冲液（pH8.0）或双蒸水将引物稀释到10µmol/L。—引自《农业部953号公告－6－2007》检测基因引物引物序列(5’-----3’)PCR产物大小(bp)Primer1SPS-F1:TTGCGCCTGAACGGATATSPS277Primer2SPS-R1:GGAGAAGCACTGGACGAGGPrimer135S-F1:GCTCCTA

6、CAAATGCCATCATTGCCaMV35SPrimer219535S-R1:GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCPrimer1NOS-F1:GAATCCTGTTGCCGGTCTTGNOS180Primer2NOS-R1:TTATCCTAGTTTGCGCGCTAPrimer1Bt-F1:GAAGGTTTGAGCAATCTCTACBt301Primer2Bt-R1:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT2、设置对照在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。设置两个阴性对照：用非转基因玉米材料中提取的DNA作为PCR反应体系的

7、模板；设置两个阳性对照，用转Bt基因玉米含量为1%的玉米DNA作为PCR反应体系的模板；设置一个空白对照：用无菌重蒸水作为PCR反应体系的模板3、反应体系制备1）体系制备。一组样品(包括样品/阳性/阴性/空白对照)的体系要一起制备，每个试样2次重复。取1.5ml离心管，按照表A.2给出的顺序依次加入试剂。在配制反应体系时所有的试剂都应置于冰上。用移液器轻轻混合反应体系并轻微离心！PCR反应体系（不包含模板DNA）试剂终浓度单样品体积10样品体积ddH2O14.375µl143.75µl10×PCR缓冲液1×2.5µl25µl25mmol/LMgCl22.5m

8、mol/L2.5µl25µldNTPs0.2mmol