生物技术第五讲1植物细胞悬浮培养技术

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1、植物细胞悬浮培养技术单细胞的分离由完整的植物器官分离单细胞由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞1由完整的植物器官分离单细胞机械法酶解法叶片是分离单细胞的最好材料1.1机械法方法A：用刀片刮叶片(花生成熟叶片)具体方法:撕去表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞方法B：叶片研碎、离心轻轻研磨加研磨介质过滤、离心研磨介质：40ml20umolSucrose10umolMgCl220umoltris—HCL(三羟甲基氨基甲烷)PH7.8注意：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。注意：大麦、小麦和玉米

2、很难通过酶解法使细胞分离。（叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间形成一种互锁结构）事例分离篱天剑叶肉细胞的机械方法叶片消毒匀浆过滤离心植板75％酒精，7％次氯酸钠10ml培养基1.5克1cm2叶片低速，去碎屑，游离细胞沉降1.2酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心1.3机械法和酶解法比较机械法酶解法细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离；细胞产量低；细胞易破。细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。2由培养组织（愈伤组织）分离单细胞材料：胡萝卜肉质根步骤：1

3、诱导产生愈伤组织2愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；摇床用于振荡继代悬浮3Subculture将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。植物细胞悬浮培养技术（Suspensionculture）特点：细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。必须指出：悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。概念：是指一种在受到不断摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养

4、系统。1、起始悬浮液的制备愈伤组织液体培养基摇床振荡悬浮培养质地疏松，细胞分散程度大；质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养转速30～150rpm防细胞破裂2、悬浮培养的基本形式分批培养连续培养2.1分批培养（Batchculture）2.1.1含义：将细胞分散在一定容积的培养基中进行培养。在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。2.1.2特点培养基体积固定当培养基中的营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长也停止必须适当搅拌2.1.3继代的

5、方法和最佳时期继代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。注意：要适当稀释继代最佳继代时期：选择指数生长期和直线生长期。2.1.4细胞生长曲线在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈S形曲线滞后期(lagphase)指数生长期(exponentialphase)直线生长期(linearphase)减慢期(progressivedecelerationphase)静止期(stationary

6、phase)培养时间培养细胞数目1234512345滞后期(lagphase)细胞很少分裂，其时间长短取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少培养时间培养细胞数目123451指数生长期(exponentialphase)细胞分裂活跃，细胞数目迅速增加培养时间培养细胞数目123452直线生长期(linearphase)细胞生长和发育最快的时期培养时间培养细胞数目123453减慢期(progressivedecelerationphase)由于培养基中某些营养物质已经耗尽，或是由于有毒代谢产物的积累，细胞的增长

7、逐渐减慢培养时间培养细胞数目123454生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。静止期(stationaryphase)培养时间培养细胞数目123455小结：（1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。（2）加入条件培养基可以缩短滞后期。条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。（3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持指数生长期。（4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。操作注意事项：对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔

8、径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2～4细胞），使用吸管或注射器。继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。2.2连续培养（Continuousculture）加入培养基排出培养基及其培养物二者体积相等分：开放式连续培养封闭式连续培养