生物素亲合素放大技术(I)

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1、第十一章生物素-亲合素放大技术生物素（biotin,B）是一种小分子生长因子,又称维生素H或辅酶R动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高MW244.31kD.I环为咪唑酮环，可与亲合素结合Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构I咪唑酮环Ⅱ噻吩环羧基第一节生物素理化性质与标记一、活化生物素生物素侧链的末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)生物素活化活化生物素易与抗原、抗体酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物标记蛋白质氨基的活化生物素标记蛋白质醛基的活化生物素标记蛋白质巯基的活化生物素标记核酸的活化生物素CNHNHCHCH

2、2CHCHOS(CH2)4COOHNH2COCH2CH2CONHOHCOONCOOCCH2CH2EDC标记蛋白质氨基的活化生物素生物素N-羟基丁二酰胺碳二亚胺生物素羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS）活化生物素BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质如何减小空间位阻？长臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离标记蛋白质醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物主要用于标记偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接后，再与无水肼反应而成。除

3、醛基外，BCHZ还可标记氨基标记蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素标记核酸的活化生物素光敏生物素(photobiotin)侧链上连接的芳香基叠氮物基团,经光照后,变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成B-核酸探针N3NO2NH(CH2)3N(CH2)3CH3NHC(CH2)4SNHNHO生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。BNHS和BHZ可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。二、生物素标记蛋白质活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记－多

4、价性；对BNHS多标记抗体,BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后活性将降低；选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白质比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜为2:1,IgG应用浓度0.5~5μg/ml;生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；使用交联臂减少空间阻力第二节亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素

5、（AV）或链酶亲合素（SA）结合。结构四亚基糖蛋白四肽链蛋白无糖基PI10.56结合位色氨酸色氨酸生物素44Ka10151015活性13～1515～18亲合素（A）链霉亲合素(SA)一、理化特性二、亲合素/链霉亲合素标记标记物：小分子示踪物125I、胶体金、荧光素、化学发光物大分子物质如酶抗原、抗体亲和素的标记：HRP的标记改良过碘酸钠法戊二醛法过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2AvidinOOONNAvidinAvidinH2ONAvdinNaBH4Schiff碱酶-五炭糖环戊二醛法酶－NH2亲和素－NH2＋(CH2)3CHOCHO(CH2)3CHN酶CHN

6、亲和素B-E+AABC2.亲和素－生物素化HRP复合物的制备链霉亲和素的标记方法：过碘酸钠法HRP+NaIO4+SA透析+KBH4沉淀过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2SAvidinOOONNSAvidinSAvidinH2ONAvdinKBH4Schiff碱酶-五炭糖环第三节生物素-亲合素系统的特点一、灵敏度高二、特异性强三、稳定性好四、适用性广五、其他第四节生物素-亲合素系统的应用生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域

7、中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。一、生物素-亲合素系统基本类型及原理BAB法：Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E+A+AABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC++ABCB-E+AABCAb-Ag-Ab-