目的基因的克隆与基因文库的构建(I)

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1、生物工程专业核心课程基因工程华东理工大学张惠展基因工程523416789基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程5目的基因的克隆与基因文库的构建CPCR法BcDNA法A鸟枪法D化学合成法E基因文库的构建5目的基因的克隆与基因文库的构建基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后

2、输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。A鸟枪法5目的基因的克隆与基因文库的构建鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基

3、因的克隆分离鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛

4、选模型的建立）鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接在连接前将DNA片段进行分级分离2.0kb1.6kb1.8kb鸟枪法操作的改进冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法凝

5、胶DNA片段回收技术鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构BcDNA法5目的基因的克隆与基因文库的构建cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA法分离目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性cDNA法克隆目的基因的基本战略mDNAcDNA第一链的合成5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一链引

6、物退火逆转录酶dNTPscDNA第二链的合成煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTOH3’KlenowdNTPsS1cDNA第二链的合成DNApoldNTPsRNaesH置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAA

7、AAAAAAAAAAp5’5’S1AAAATTTOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH3’AAAAAAAAAAAAAA5’5’TTTTTTTTTTTTTT3’3’T4-DNAligasecDNA第二链的合成dCTPTdT引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5GGAAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5GGAAAAACCCCCCCOH3’3‘HOCCC