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《PCR_RFLP技术应用于鉴定美洲斑潜蝇和番茄斑潜蝇的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、第18卷武夷科学Vol.182002年12月WUYISCIENCEJOURNALDec.2002文章编号:1001-4276-(2002)01-0060-05PCR-RFLP技术应用于鉴定美洲斑潜蝇和番茄斑潜蝇的初步研究陈萍,温硕洋,曾玲(华南农业大学昆虫生态研究室,广州510642)摘要本文试探运用PCR-RFLP技术,从美洲斑潜蝇(Liriomyzasativae)和番茄斑潜蝇(Liriomyzabryoni-ae)中提取总的DNA,根据实蝇18S和5.8S保守序列设计一对引物扩增这两种斑潜蝇的I
2、TS1基因区域,用五种限制性内切酶对PCR产物进行酶切,构建了酶切图谱。从酶切图谱中选择特异酶切位点作为区分两种斑潜蝇的标记。根据特异的酶切片段来区分这两种斑潜蝇。关键词美洲斑潜蝇,番茄斑潜蝇,ITS1,PCR-RFLP,限制性酶切图谱中图分类号:Q953文献标识码:A1前言斑潜蝇属全世界已知300多种,许多种类因其寄主较广,危害严重,被许多国家和地区列为重要的检疫性害虫。中国大陆及台湾至今已知有14种(杨龙龙,1995),其中全国境内检疫的种类有:美洲斑潜蝇(Liriomyzasativae),番茄
3、斑潜蝇(Liriomyzabryoniae),南美斑潜蝇(Liri-omyzahuidobrensis),三叶草斑潜蝇(Liriomyzatrifolii)四种。其中,美洲斑潜蝇和番茄斑潜蝇在广东省各地区分布广,为害严重。斑潜蝇属各个种的外部形态极其近似,幼虫、蛹更难从形态上区分。而且检疫工作中发现的斑潜蝇多为幼虫或蛹,难于及时地进行形态鉴定,为检疫带来了不便。分子生物学技术的应用为检疫害虫的及时鉴定提供了快捷而准确的途径。用于种类分子鉴定的技术有很多,新的方法也在不断的发表,比如设计特异引物来扩增目
4、的基因、RAPD、目的基因的PCR-RFLP、AFLP、微卫星DNA、以及目的基因的直接测序等,PCR-RFLP是其中一种较为容易、快速、可靠的方法。真核生物细胞核基因组中的rDNA是由编码区和非编码区所构成的一个重复单位。编码区包含18S、5.8S和28S亚单位,在进化中是较为保守的,通常作为属以上阶元的遗传标记;非编码区包括ITS1(内转录间隔区1)和ITS2(内转录间隔区2),进化速度较快,适合于种级或种群间的遗传多样性分析;ITS1片段位于18S和5.8SrDNA之间,是研究种和种群遗传多样性
5、一种常用而有效的分子标记之一。根据生物在长期的进化过程中,不同物种的DNA序列会产生不同程度的变异,从而体现在限制性内切酶识别位点的不同,酶切后会产生不同数量的酶切片段以及片段大小的差异,由收稿日期:2002-06-10第18卷陈萍等:PCR-RFLP技术应用于鉴定美洲斑潜蝇和番茄斑潜蝇的初步研究·61·此构建酶切图谱。本文参考实蝇的18S和5.8S的保守序列设计了适合斑潜蝇的特异引物,对美洲斑潜蝇和番茄斑潜蝇的模板DNA进行ITS1基因区域扩增,用5种识别4碱基对的限制性内切酶(AfaⅠ、MaspⅠ
6、、HaeⅢ、MboⅠ、AluⅠ)分别对PCR扩增的ITS1基因区域进行酶切并比较,初步探讨PCR-RFLP运用于鉴定美洲斑潜蝇和番茄斑潜蝇的可行性和可靠性。2材料与方法2.1材料2.1.1虫源美洲斑潜蝇在广州市郊岑村采集,番茄斑潜蝇在珠海斗门采集。供试虫均浸于95%乙醇中用于模板DNA的制备。2.1.2试剂五种限制性酶均购自宝生物工程(大连)有限公司,EDTA、琼脂糖购自基因有限公司,SDS为Serva有限公司进口分装;dNTPs、TaqDNA聚合酶购自华美生物工程公司;GeneRuler(tm)10
7、0bpDNAmarker购自上海生物工程公司,其他试剂为国产分析纯。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。18SF的引物序列为:5'—GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG—3'5.8SR的引物序列为:5'—GTCCTGCAGTTCACACGATG—3'2.2方法2.2.1总DNA的抽提按照昆虫生态研究室昆虫基因多样性实验室痕量样品快速抽提DNA的方法(温硕洋等,待发表):取斑潜蝇1头,若标本是用酒精泡的,先用TE泡半小时;若是干标本,则要先用水软化过夜,然后再用TE泡。从处理后的样品中切出带有肌
8、肉的一小部分腹部体壁,置于30ul的研磨缓冲液(100mMTris-cl,1mMEDTA,25mMNacl,200ug/mlProteinaseK)中,用烧钝的tip头充分研磨,再用30ul的研磨缓冲液洗涤tip头,约60ul的研磨液置56℃温浴消化2个小时。消化后,95℃温浴45秒使蛋白酶K变性,2000～3000rpm/min离心30秒沉淀杂质,上清液作为做PCR的DNA模板,-20℃下贮存备用。2.2.2PCR(Polymerasechainrea
