冠瘿病菌检疫技术操作办法

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1、冠瘿病菌检疫技术操作办法字体：大中小  2009-9-1  来源：省林检局  阅读：134次  [关闭]1主题内容及应检范围1.1本办法规定了冠瘿病菌Agrobacteriumtumefaciens(SmithetTownsend)Conn的检疫检验及检疫处理操作办法。1.2本办法适用于林业植物检疫机构对杨属Populusspp.、柳属Salixspp.、苹果属Malusspp.、梨属Pyrusspp.、蔷薇属Rosaspp.、山楂属Crataegusspp.、李属Prunusspp.、栗属Castaneaspp.、葡萄属Vitisspp.等

2、林木、果树和木本花卉植物活体、残体的检疫检验和检疫处理。2产地检疫2.1种苗繁育基地的建立2.1.1应选用无疫情的繁殖材料。2.1.2有疫情发生的地块，3年内不再繁育其寄主植物。2.2踏查2.2.1在种苗繁育基地、林地、果园和木本花卉栽植地，以自然界线、道路为单位进行线路（目测）踏查。2.2.2调查罹病植株是否表现矮化、干枯，叶片是否黄化、早落，根系是否细小、须根少。2.2.3调查中、幼龄植株的根冠部是否有灰白色、球形或扁球形的光滑软质瘤，是否有褐色、深褐色、表面粗糙龟裂、周围和表面生有细根的木瘤；根茎和主干上是否有表面粗糙、龟裂、质地坚硬的

3、木瘤。2.2.4确认有疫情需进一步掌握危害情况的，应设标准地（或样方）做详细调查。2.3标准地（或样方）调查2.3.1种苗繁育基地样方设置与调查2.3.1.1样方的累积面积应不少于调查总面积的5%。2.3.1.2每块样方面积为10m2，在样方内按“Z”形线路取样，抽取样株不得少于20株。2.3.2林分标准地设置与调查2.3.2.1按林分面积设置，10hm2以下（含10hm2）设1块，10hm2以上按总面积的2%设置。2.3.2.2每块标准地面积为0.1hm2，在标准地内随机抽取20–30株进行调查。2.4病害分级标准轻被害株率5%以下；中被害

4、株率6%–15%；重被害株率16%以上。3调运检疫3.1抽样比例3.1.1苗木按一批货物总件数（株）的5%抽取，少于5件或50株的应全部进行调查。3.1.2疫情严重的，需扩大抽样数量，至少应扩大到该批货物总件数（株）的10%。3.2抽样方法3.2.1苗木按照抽样比例，采取分层方式设5个样点进行抽样。3.2.2将抽取的样品放在100cm×100cm的白布（或塑料布）上，逐株进行检查。3.3现场检验3.3.1检查寄主植物的根冠部是否有瘤状突起，是否有带细根的木瘤，是否有大小不一、形状不同或互相连结的瘤。3.3.2检查寄主植物的根茎和主干上是否有表

5、面粗糙、龟裂、质地坚硬的木瘤。4检疫检验4.1分离培养检验4.1.1取新鲜幼嫩根瘤，用解剖刀切成约2mm×2mm的小块，置于灭菌培养皿内，放入灭菌水清洗并去除陈腐组织和杂质。4.1.2将洗净的材料在70%酒精里蘸5s，在酒精灯火焰中来回3次后，放入灭菌水里清洗3次。4.1.3将经过上述处理的材料放入研钵内，加入适量灭菌水研碎后静置10min。4.1.4用接种环蘸取上述分离材料的组织液，接种在YEM培养基上划线分离。检查培养基上是否形成有光泽、隆起、边缘完整、半透明、呈灰白色至淡灰棕色的粘稠圆形菌落。4.2形态与染色检验4.2.1形态观察4.2

6、.1.1将分离到的细菌在YEM培养基上培养24–48h，用移菌环挑取少许菌苔放入无菌水试管中配成108CFU/ml菌悬液，取菌液滴在载玻片上，立即将载玻片倾斜，使菌液迅速流成菌液膜，风干并通过火焰2–3次使菌体固定。4.2.1.2用酸性苯酚品红染色1min，用清水冲去染液，待干燥后用油镜观察菌体形态（杆状）。4.2.2革兰氏染色采用结晶紫草酸胺染色法。经固定涂片→染色1min→水洗数秒吸干→碘液处理1min→水洗数秒吸干→褪色30s→水洗数秒吸干→复染10s→水洗吸干后镜检。土壤杆菌属为革兰氏阴性，呈红色。4.2.3鞭毛染色采用西萨—基尔（C

7、esares-Gill）染色法。经染媒剂5–7min处理→水洗干燥→苯酚品红染色5min→水洗干燥后镜检。土壤杆菌属镜检菌体和鞭毛为阴性反应，呈红色，鞭毛1–6根。4.3生理生化检验4.3.1生长与温度试验生物变种1可以在35℃生长，生物变种2和生物变种3则不能生长。4.3.2耐盐性试验生物变种1和生物变种3可在含2%NaCl的培养液上生长，而生物变种2不能生长。4.3.33-酮基乳糖试验4.3.3.1将菌种接种在GYCA培养基斜面上培养1–2d，再将细菌点种在乳糖培养基平板上，每皿接种4–6个菌株，培养1–2d，使每个菌落直径达0.5cm。

8、4.3.3.2在培养皿上加Benedict试剂，1h之内在菌落周围产生一圈黄色的Cu2O为阳性反应。生物变种1为阳性反应，生物变种2和3均为阴性反应。4.4碳素化合