蛋白质的提取、纯化

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1、生物化学研究进展 作业  题目     蛋白质的提取、纯化        姓名                   学号                   班级                   专业                      题目：蛋白质的提取、纯化 姓名：  专业：  摘  要：本文综述了蛋白质的提取原理及方法，蛋白质纯化的意义、基本原则及方法，蛋白质纯化的前景展望。 关键词：提取原理 提取方法 水溶液 有机溶剂 双水相萃 纯化 意义 基本原则 方法 溶解度 带电性质 电荷数 配体特异性 前景 正文： 1 蛋白质样品的提取 1．

2、1蛋白质样品的提取原理 提取蛋白质的基本原理主要有两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。 1．2 蛋白质样品的提取方法 1．2．1 水溶液提取法  稀盐和缓冲系统的水溶液是提取蛋白质最常用的溶剂。通常用量是原材料体积的1—5倍，提取时需要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成分性质而定，一般在低温(5℃ 以下)下操作。另外，蛋白质和酶是两性

3、电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH值范围内。一般来说，在避免极端pH值的前提下，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。此外，稀浓度可促进蛋白质盐溶，并且盐离子与蛋白质部分结合，能够保护蛋白质不易变性。因此可在提取液中加少量NaC1等中性盐，一般以0．15 mol／L浓度为宜。 1．2．2 有机溶剂提取法  一些和脂质结合牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶都不溶于水、稀盐溶液、稀酸或碱，可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，具有一定的亲水性和较强的亲脂性，并且不会残留在产品中，容易蒸发除去，密度低，与沉淀物质的

4、密度差大，便于离心分离。但不足的是用有机溶剂来提取蛋白质比用盐析法更容易引起蛋白质变性。 1．2．3 双水相萃取法  双水相萃取法是依据物质在两相间的选择性分配，当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用、各种力(疏水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同，进而分离目的蛋白。此方法可在室温下进行，双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性，收率较高。对于细胞内的蛋白质，需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩，细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白，会受聚合物分子质量及浓度、溶液pH值

5、、离子强度、盐类型及浓度的影响。 2 蛋白质的纯化 2.1 蛋白质纯化的意义 随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学的掌握生命现象和活动规律，更完善的揭示生命本质。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此，高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。 2．2 蛋白纯化的基本原则 2．2．1 蛋白纯化开始之前需了解最终产品的用途

6、  只有了解最终产品的用途，才能设计蛋白质的纯化过程，同时还要综合考虑产品的质量、数量和经济性等方面的要求。依据目的蛋白的用途来预计纯化过程需要的时间和成本。 2. 2．2 合理设计纯化方案  通过了解待纯化样品中目的蛋白和主要杂质的性质，如蛋白质的来源、分子大小、等电点和稳定性，以及蛋白质是可溶还是不可溶，是胞内还是胞外，来设计合适的纯化方案。 2．2．3 需要利用蛋白间内在的相似性与差异  可利用相似性来除去非蛋白物质。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异即可将蛋白从混合物(如大肠杆菌裂解物)中提取出来并

7、得到重组蛋白。 2．2．4 选择适当的发酵系统和发酵条件  发酵过程和蛋白质的分离、纯化过程是相互影响的，合适的发酵将有助于发酵产品的分离及蛋白质的纯化。要严格控制、防止蛋白酶和细菌的污染。 2．2．5 保持蛋白质的活性  规模化纯化蛋白质时，要保持蛋白质的活性，减少蛋白质的变性失活。选择适当的操作温度(尽量在低温下进行)、pH值和泵，尽量缩短操作时间。 2．3 纯化蛋白质的方法 2．3．1 根据溶解度不同来纯化蛋白  具体方法有盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法。 蛋白质表面的亲水性氨基酸使其能溶于水，溶解度受溶液的pH值、离子强度、溶剂的电解质

8、性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条件下，不同蛋白质有不同的溶解度，可据此来分离蛋白质。中