淀粉液化及糖化实验

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1、淀粉液化及糖化实验一、实验目的1.掌握用酶解法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法；2.掌握还原糖的测定方法。二、实验原理在发酵过程中，因有些微生物不能直接利用淀粉，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水解成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程成为淀粉的糖化，所制得的糖液成为淀粉水解糖。水解淀粉为葡萄糖的方法包括酸解法、酸酶结合法和酶解法。实验室常采用酶解法制备淀粉水解糖。酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法葡萄糖可分为两步：第一步是利用α-淀粉酶将淀粉转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第

2、二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，这个过程在生产上成为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故该方法也称为双酶法。1.酶解法液化原理淀粉的酶解法液化是以α-淀粉酶作为催化剂，该酶作用于淀粉的α-1,4-糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以α-淀粉酶也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后，其碘色反应发生以下变化：蓝色→紫色→红色→浅红色→不显色（即显碘原色）。酶解法液化因生产工艺不同分为间歇法、半连续法和连续法；液化设备分为管式、罐式和喷射式；加酶方法包括一次加酶

3、法、二次加酶法和三次加酶法；根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法及中温酶和高温酶混合法。本实验采用：高温酶法，间歇式，罐式，一次加酶法。2.酶解法糖化原理淀粉的酶解法糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非还原末端以葡萄糖为单位依次分解淀粉的α-1,4-糖苷键或α-1,6-糖苷键，由于是从链的一端逐渐一个个地切断为葡萄糖，所以糖化酶也成为外切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中有水的参与反应，故糖化的理论收率为111.1%(C6H10O5)n+H2O→nC6H12O616218180淀粉糖化实际收率的计算公式：淀粉糖化实际收率=淀粉

4、转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。淀粉转化率的计算：淀粉转化率=糖化液中还原糖（以葡萄糖计）占干物质的百分比，称为DE值。用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。DE值的计算公式：DE值=×100%还原糖含量用3,5-二硝基水杨酸（DSN）比色法测定，表示方法：g葡萄糖/100mL糖液。干物质含量用阿贝折光仪测定，表示方法：g干物质/100mL糖液。本实验采用淀粉干重替代(即原料中纯淀粉含量为100%)。糖化时间与糖化酶用量的关系见表1。表1糖化时间与糖化酶用量关系表糖化时间/h68101624324872糖化酶用量（U

5、/g淀粉）480400320240180150120100三、实验仪器与试剂1.仪器分光光度计、恒温水浴锅、烘箱、滴定管、酸度计、电炉、离心机、白瓷板、烧杯、试管等。2.试剂玉米淀粉、α-淀粉酶、糖化酶、PH试纸、盐酸、葡萄糖溶液、DNS试剂、无水酒精等。磷酸-柠檬酸缓冲液（PH6.0）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g，柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用蒸馏水溶解定容至1000mL，配好后应以酸度计调整PH值为6.0。原碘液（存储液）：称取0.5g碘和5.0g碘化钾，研磨，溶于少量蒸馏水中，然后定容至

6、100mL，储存于棕色瓶中备用。稀碘液（工作液）：取1m/L原碘液用蒸馏水稀释100倍（当天制备）。反应终止液：0.1mol/L硫酸。四、实验方法1.淀粉的液化配置30%的淀粉乳（按照0.1L配制）两份，调节PH值至6.5，加入氯化钙（固形物0.2%，钙离子的存在可以保持α-淀粉酶在水解过程中保持活力和稳定性），加入α-淀粉酶（12~20U/g淀粉）；在剧烈搅拌下，先加热至72℃，保温15min；再加热至90℃，并维持30min，中间不停止搅拌，以达到所需的液化程度（DE值15~18%）；取小样检测碘色反应呈棕红色；液化反应后，再升温至

7、100~120℃，保持5~8min，以凝聚蛋白质；以6000r/min离心5min得到上清液。2.淀粉的糖化迅速将上述上清液用盐酸将PH调至4.2~4.5，同时迅速降温至60℃；然后加入糖化酶（酶活力为10000U的酶液0.5mL），于60℃保温1~2h；当用无水酒精检验无糊精存在时，将溶液PH值调至4.8~5.0，同时，将溶液加热至80℃，保温20min；然后将溶液温度降至60~70℃，以6000r/min离心5min即得到糖上清液；量取该糖液体积，取样分析还原糖含量(测定方法参见附录“葡萄糖含量的测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）”

8、相关内容)。五、实验结果1.在详细记录实验数据基础上完成下表，计算淀粉转化率。（1）葡萄糖含量测定①吸光度测定试剂试管编号0123451mg/mL葡萄糖溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（m