细胞自噬检测

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1、2.5细胞裂解细胞从培养皿上被刮下来之后，在15ml灭菌塑料试管中用PBS洗涤3次，每次洗涤用10mlPBs充分重悬细胞，在4“c下5009离心5min。所有操作在冰上进行。最后一步洗涤把细胞转移到1.smlePpendorf管中。把细胞充分重悬在TAP细胞裂解液中。根据细胞量决定裂解缓冲液的体积(一般每10川细胞用100川一200川TAPBu价r)。放置于冰上30min，每10min用移液枪吹打细胞一次使之充分悬浮。在4OC下用100009高速离心15min，把上清转移到新的试管中进行下一步实验，丢弃沉淀。2.13细胞自噬活性的检测我们主要通过两条途径来诱导细胞发生自噬，一饥饿处理

2、，二药物RaPamycin处理。对于饥饿处理，吸去正常培养的细胞中的培养液，用PBS小心洗涤细胞三次，注意不要使细胞脱离培养皿，加入15mlEBss(用量根据培养皿的大小而定)连同2林M的ED64和pePstatin。在37“C培养箱中培养2一4h。对于RaPamycin处理，在普通细胞培养液中加入终浓度为500nM的R叩amyein(sigma)37“e下培养12h。细胞自噬活性的检测主要有两条途径，一条是通过转染GFP一LC3，再用荧光显微镜观察LC3在细胞质中的聚集。二是用westemblotting和LC3的抗体，检测细胞内源LC3n的增加。对于荧光显微镜分析，在U20S细胞

3、中转染GFP一LC3，24h之后，把细胞继代培养在有盖玻片的6孔板中，诱导自噬，吸去培养液，用PBS小心润洗玻片1次，在每个孔内加入3%的多聚甲醛，在室温下闭光摇晃培养玻片20min。用PBS洗涤玻片3次，每次每孔加2mlPBS在室温下摇晃10min，用固定液把盖玻片固定在载玻片上，在室温下干燥1min之后用荧光显微镜观察。对于westemblotting，从培养皿上收集药物或饥饿处理之后的细胞，加入1‘SDS蛋白上样缓冲液，并用超声波处理直到不粘稠为止，95“e煮沸样品5min，室温下高速(100009)离心5min，通过SDs一pAGE并用LC3的抗体(sigma)进行weste

4、mblotting检测，自噬活性越高的细胞内LC3n的条带浓度越高。　1.2.1自噬体检测　　实验分为3组,分别为自噬诱导组,自噬抑制组和雷帕霉素组。自噬诱导组:1×105RAW264.7细胞培养至对数生长期,加入50nmol/L雷帕霉素作用3h,然后按感染复数（MOI）=1∶10比例加入1×109CFU/L的H37Rv菌株培养3h,PBS（pH7.4）缓冲液洗脱3次以洗脱未结合的H37Rv菌株。自噬抑制组:RAW264.7细胞加入自噬抑制剂3MA（600mg/L）作用36h,然后按MOI=1∶10比例接种H37Rv菌株作用3h。雷帕霉素组:RAW264.7细胞培养至对数生长期,加入

5、50nmol/L雷帕霉素作用3h。上述各组细胞胰酶消化后收集,20g/L锇酸固定过夜,透射电镜观察自噬体的形成。　　1.2.2菌落形成单位（CFU）检测　　自噬诱导组和自噬抑制组细胞胰酶消化后收集,加入2倍体积双蒸水裂解细胞,7000r/min离心,收集沉淀,重悬后1∶107稀释,取100μL悬液接种于7H10培养基,37℃培养21d进行菌落计数。　2结果　　2.1自噬体检测　　雷帕霉素作用于RAW264.7细胞后,以H37Rv菌株感染细胞,透射电镜可发现细胞中有大量由单层膜组成的自噬囊泡出现,同样雷帕霉素组也可诱导产生自噬体形成。而以自噬抑制剂3MA处理RAW264.7后,细胞中

6、未发现自噬囊泡（图1）。　　2.2CFU检测　　H37Rv菌株感染细胞后裂解,稀释后接种于7H10培养基,经过21d培养,计数CFU。自噬诱导组H37Rv菌株CFU为4.12±0.32,而3MA处理后CFU为6.43±0.11,两组相比有统计学意义（P<0.05）。这些结果说明自噬体产生后可对胞内感染的H37Rv菌株有一定的清除作用。1．3免疫荧光法观察长春瑞滨给药后A549细胞内LC3蛋白表达的变化A549细胞接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片于6孔板中，待细胞贴壁后加入一定浓度的长春瑞滨同时设立阴性对照和空白对照，培养不同时间(O一24)h后，于盖玻片上4％多聚甲醛固定细胞15min，

7、固定的细胞用PBS洗两次后，加入0．25％Triton—X100冰上放置5min，PBS洗2次，然后加入1％牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)处理30min，加入I％BSA稀释的羊抗人MAPl一LC3一II(1：200)，4oC孵育过夜，次日用PBS洗3次后，加)LFITC标记的兔抗羊IgG(1％BSA以l：20的比例稀释)，室温下避光孵育30min，PBS再次洗涤细胞后，用lO¨g／mLPI和RnaseA室温下细胞核DNA染色3