TALEN和CRISPER基因靶向技术

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1、2013,11,13划时代的靶向基因操作技术-TALEN和CRISPR/Cas9OutlineBackgroundTranscriptionactivator-like(TAL)effectorCRISPR/Cas9我们研究一个作物的性状，最终都需要做一件事：改变基因，从必要性和充分性两方面阐明基因功能。1）Lossfunction：降低基因或删除基因Givefunction:提高基因的表达Background生物学家的梦想：随心所欲地操作基因划时代的基因靶向操作技术：TALE与CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦我们不再大海捞针！！！经典基因操作：

2、Genetrap:化学诱变；转座子--------海量的筛选+goodLuck同源重组：一般物种几率低,10-6；EScell10-2难！3.突破性的发现：RNAi-Knockdown;不完全敲除，临时性。4.充满梦想却幻灭的ZFN：难以完全找到匹配的3连子锌指；Off-target严重。美国加州大学DaveSegal教授说：“Withzincfingers,wehavetolettheDNAtelluswherewetarget”5.完美基因靶向操作：识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶TALEN技术形成的关键研究SugisakiHiroyukiJe

3、nsBoch发现FokI核酸酶破译TALE序列（1981）（2009）DanielF.VoytasAdamJ.Bogdanove将TALEDNA结合motif与FokI核酸酶融合，推出与ZFN同类型的双链DNA剪刀，称之为TALEN。(2011)TALE的发现迅速成为科技最前沿TALEdomain:DNA识别域TALE，植物病原体黄单胞菌Xantomonas–用于调控宿主基因由34个氨基酸长度的重复单位构成第12，13位点氨基酸（repeat-variabledi-residue，RVD）不同RVD决定识别位点不同Nucleasedomain:DNA剪切

4、域FokI，发现于海床黄杆菌Flavobacteriumokeanokoites采取其非特异性DNA剪切结构域形成二聚体时发生剪切N’C’TALEFokILTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGNI→AHD→CNG→TNN→GATTCTGCTAACTCATACTALEN核酸酶DNA识别域DNA剪切域FastTALETM连接TALENN’C’N’C’TALENmodulesat9positionsTALENbackbonevectorsTALENassembledvectorsPromoterFokIPromoterFokIx4

5、x16x4x16x4x16x4x16x4x16x4x16x16x16x4x16Position1Position2Position3Position4Position5Position6Position7Position8Position91/29x16dimers,7x4monomersCompletelibrary:172CMV,EF1a,Ubi,35S,T7,SP6MaximumRVDs:19MinimumRVDs:12一步连接只要4-5小时，这些片段就全部连接亚克隆到植物表达载体上通过Ti载体介导转染插入植物基因组中，然后表达目标蛋白-TALEN

6、，TALEN剪切DNA，造成突变体。最后通过交配将TALEN去除，达到无痕基因敲除的目的。WetargetedthericebacterialblightsusceptibilitygeneOs11N3(alsocalledOsSWEET14)forTALEN-baseddisruption.ThisricegeneencodesamemberoftheSWEETsucrose-effluxtransporterfamilyandishijackedbyX.oryzaepv.oryzae,usingitsendogenousTALeffectorsAvr

7、Xa7orPthXo3,toactivatethegeneandthusdivertsugarsfromtheplantcellsoastosatisfythepathogen‘snutritionalneedsandenhanceitspersistence.TheOs11N3promotercontainsaneffector-bindingelement(EBE)forAvrXa7,overlappingwithanotherEBEforPthXo3andwiththeTATAbox.Os-11N3插入突变或者被RNA介导沉默后，对那些依赖AvrX

8、a7和PthXo3的致病小种的特异感病性丧失。24bp17bp24bpWedep