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《珍稀濒危树种毛红椿微卫星dna分离及ssr反应体系优化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(12):50~55珍稀濒危树种毛红椿微卫星DNA分离及*SSR反应体系优化121**11刘军孙宗修陈益泰何贵平吴天林(1中国林业科学院亚热带林业研究所富阳3114002中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室杭州310006)摘要以江西宜丰种源毛红椿为材料,成功提取其基因组DNA。利用改良的链亲和素磁珠法亲和捕捉出毛红椿基因组微卫星DNA片段,并构建了富含微卫星的基因组文库。从构建的基因组文库中随机挑选了63个单克隆进行测序,其中50个单克隆成功测序,含有微卫星的单克隆有18个,并根据测序结果设计并合成SSR引物18对。利
2、用所合成的引物优化SSR反应体系,对影响SSR反应的各个因子进行了探讨。确定了模板DNA最适浓度为30ng;dNTP的最适浓度为0.3mmol/L;0.3Lmol/L是引物在反应体系中的最合适浓度。建立了重复性好、稳定性好的SSR反应体系,为下一步进行毛红椿群体遗传结构和遗传变异研究提供了技术支持。关键词毛红椿微卫星链亲和素磁珠SSR反应体系中图分类号Q819毛红椿[Toonaciliatavar.pubescens(Franch.)等优点,是构建遗传连锁图谱、研究群体遗传学、进行[5,6]Hand.]是楝科香椿属植物,零星分布于江西、湖南、湖分子标记辅助育种和系谱分析的理想工具。微卫[1
3、]北、四川、广东、贵州和云南等地。毛红椿为落叶大乔星最大的缺点是对首次研究的物种要从中分离微卫星木,生长迅速,树干通直,素有/中国桃花木0之称,材质曙DNA,这主要是因为微卫星通常存在于基因组的非编红,木纹美丽,是珍贵的用材树种,具有很高的经济价值码区。传统的微卫星DNA分离方法是先建立基因组和开发前景。由于环境变化、人为砍伐以及其天然更新文库,再用含微卫星的探针与之杂交筛选文库,可以说比较慢,数量不断减少。在《中国植物红皮书》中,毛红椿是一种费时费力的工作。应用这种传统方法分离微卫被列为国家二级保护濒危种,毛红椿也被各分布省列为星DNA所得到的阳性克隆(含微卫星DNA)的数量只[2,3]
4、珍惜濒危树种。目前毛红椿人工林的用种主要采自[4]有全部克隆的0.04%~12%。近几年来,一些新的数量较少的天然林和人工林,所以进行系统的良种选育微卫星DNA分离方法相继出现,解决了传统方法所遇和分子生物学研究,扩大毛红椿的种植面积并研究其濒[7]到的困难,提高了微卫星分离效率。本研究主要目危原因,进而采取积极有效的保护措施是非常必要的。的:(1)用改良的链亲和素磁珠法首次分离毛红椿基因微卫星DNA又称简单重复序列(singlesequence组微卫星DNA并测序;(2)根据所分离的微卫星DNArepea,tSSR),是由1~6个核苷酸组成的重复单元以首序列设计、合成SSR引物;(3)利
5、用所合成的引物优化尾相接的方式重复出现多次而形成的一段DNA序列,SSR反应体系,建立重复性好、稳定性好的SSR反应体[4]广泛分布于所有原核生物和真核生物基因组中。系,为下一步进行毛红椿群体遗传结构和遗传变异研SSR标记是一种基于DNA长度多态性的分子标记技究提供了技术支持。术,它具有共显性、高度可重复性、高度丰富的多态性1材料与方法收稿日期:2006-07-28修回日期:2006-10-241.1材料*浙江省科技重点项目(011102198)**通讯作者,电子信箱:ytc.yalin@yahoo.com.cn1.1.1植物材料2004年11月采集江西宜丰种源天2006,26(12)刘军
6、等:珍稀濒危树种毛红椿微卫星DNA分离及SSR反应体系优化51然林种子,2005年3月,在浙江省富阳市新登苗圃接,连接后转化感受态大肠杆菌DH5A,涂到含氨苄霉(N30b03cE119b57c)播种。7月份采集毛红椿幼苗幼素的LB培养基平板上培养。37e过夜培养,挑取单克嫩叶片用塑料袋密封,用冰袋保鲜,迅速带回实验室隆接种到含氨苄霉素的LB液体培养基中,180r/min摇后,保存到-70e低温冰箱。10h,取0.5ml菌液送公司(联合基因)测序。(6)SSR1.1.2微卫星分离材料链亲和素磁珠(Promega)一引物设计与合成根据测序结果,利用prmierprmiier5管(约600Ll)
7、;磁力架(Promega)一个;生物素标记探针软件设计引物,设计结果送交公司(Sangon)合成。(Sangon):5c-生物素(AG)10;接头Ⅰ序列为OligoA:5c-1.2.2SSR反应体系的优化SSR反应体系的建立以[8]ATGACCATGATTACGCCAG-3,OligoB:5c-GATCCTGG枫香PCR扩增程序为基础,以江西宜丰种源毛红椿CGTACTCATGGTCAT3c;接头Ⅱ序列为OligoC:5c
