DNA测序技术的研究进展及临床应用

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1、DNA测序技术的研究进展及临床应用胡旻涛152207000081引言如何快速并且精准地获取生物体的遗传信息，对生命科学研究具有非常重要的意义。目前普遍认为生物体上的遗传信息主要集中在基因组DNA序列上。对于基因组DNA序列遗传信息的获取与解读，可以比较全面深入全面地揭示基因组的复杂和多样性，这对于生命科学、临床医药等方面的研究都有相当重要的意义。从1977年Sanger测序技术为代表的一代测序方法的发明至今，对于DNA测序技术经历了飞速发展时期。尤其最近数年间，高通量二代测序、新一代单分子测序等大量拥有诸多优势的新技术不

2、断出现在人们视野里，甚至有研究认为测序技术的发展已快过摩尔定律。而不同的测序技术之间，各自都在读长、准确性、运行速度、运行成本、适用范围等不同因素上各有优劣，使得目前的测序市场仍处于相互竞赛的阶段，暂未出现一种技术可以完全替代其他方法。不断更新的测序技术，不断完善的技术工艺，使得测序越来越成为一种高效、快速、多功能、低成本等可以普及的研究检测手段。随着“精准医疗”的概念被广泛普及，在临床医疗方面有关测序技术所开展的项目就有产前无创筛查、肿瘤个性化用药、疾病遗传分析、药物有效性安全性分析等等。而在生命科学的研发方面更是起到

3、了非常巨大的推动作用。由于测序技术的应用日益广泛，本文针对该技术的历史、发展、优劣、应用等方面进行综述。2第一代测序技术第一代测序技术在生命科学的研究过程中发挥这举足轻重的作用，例如举世瞩目的人类基因组计划（humangenomeproject,HGP）就是基于第一代测序技术得以实现的。2.1化学降解法化学降解法的原理是将DNA片段上的5’端的磷酸基团上标记一个同位素信号源，然后根据不同的化学方法来对特定的碱基进行修饰和裂解，产生一系的列长度不等而且在5’端有同位素标记的小DNA片段，然后经过凝胶电泳分离技术使其分离，再

4、经同位素的放射自显影，确[7]定各个DNA片段的末端的准确碱基，最终得到目的DNA片段的碱基组成。化学降解法拥有准确性较好、易于掌握等明显的优点，而且由于测定的序列完全来源于起始模板DNA序列，而非扩增后的产物，由此可以避免扩增过程中引入错误。但又由于操作较为繁复，所以逐渐被另一种简单快捷的Sanger法所替代。2.2双脱氧链终止法（Sanger法）1/9Sanger法的原理为：用双脱氧核苷酸代替脱氧核苷酸作为DNA合成反应的原料，由于ddNTP的2’和3’端都不含-OH，在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此合成反

5、应会在该ddNTP被延伸到3’末端后终止。而在四个互相独立且同时进行的合成反应体系中，分别在各个反应体系内加入一定比例的带有标记的对应双脱氧的ddNTP组分（每个反应体系仅加入一种ddNTP组分），然后经过合成扩增反应、电泳和放射显影后，可以根据电泳条带的位置来[2]确定待测DNA分子的序列。Sanger法的优点在于操作简便，而技术的更新带来的是荧光测序技术，将荧光标记代替同位素标记，同时采用CCD成像系统进行全自动的测序实验，从而极大地提高了Sanger法测序的效率和准确性。目前基于Sanger法的荧光自动测序技术仍然

6、被人们广泛地应用于各个领域。3第二代测序技术3.1454测序技术454技术最早是由454LifeScience公司于2005年提出的，并且应用该技术成功地测序了[8]支原体的基因组。454技术无需特殊标记的引物和探针，也不需要进行电泳，且具有快速、准确、灵敏度高和自动化强等诸多优势，开创了新一代测序的先河，被Nature以里程碑式事件进行报道。3.1.1DNA文库的构建及PCR扩增把待测样品如基因组DNA或BAC等其他DNA模板，通过喷雾法打断为300bp-800bp的小片段，然后在每一个小片段的两端各加上相应的特殊接头

7、；另一种方法是将待测基因序列进行PCR扩增，然后连接到相应载体中，以构建相对应基因的单链DNA文库。把需要构建的单链DNA模板和在水油包被系统中的的磁珠一起孵育，这些磁珠表面含有和打断的小片段两端的接头互补配对的寡聚核苷酸序列，使单链DNA可以由此配对片段与磁珠相连接。在孵育体系中加入PCR扩增试剂，使与磁珠相连的ssDNA独立扩增，这个扩增反应可以使每个小片段被放大100万倍左右，得到测序反应所需模版量。扩增反应完成后，富集带有DNA片段的磁珠。3.1.2焦磷酸测序反应将聚合酶与单链结合蛋白富集到的结合有单链模板DNA

8、片段的磁珠周围，而后应用PTP平板固定磁珠，而这种PTP平板的特殊性在于板上有大量仅能容纳一个磁珠的小孔。然后开始焦磷酸测序：是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，通过检测DNA在延伸的过程中掺入核苷酸时会释放出的焦磷酸残基，而焦磷酸盐在被硫酸化酶转化为ATP时，2/9产生的ATP就会促使氧合荧光素的合