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1、·253·第8卷第4期中华男科学Vol.8No.42002年8月NationalJournalofAndrologyAug.2002·论著·冰冻对精子DNA的影响宋博,郑履康,邓丽霞,张桥(中山医科大学公共卫生学院遗传毒理研究室,广东广州510089)摘要:目的:探讨冰冻是否引起精子DNA损伤。方法:采用改进后的单细胞凝胶电泳法(SCGE)对-80℃条件下保存不同时间的精子DNA进行分析。结果:以DNA头部百分比为检测参数,方差分析显示,对于时间因素,P>0.05,无统计学差异。结论:冰冻不引起精子DNA损伤。
2、关键词:冰冻;精子;DNA;单细胞凝胶电泳法中图分类号:R321.1文献标号:A文章编号:100923591(2002)0420253202XFreezingEffectonSpermDNABoSONG,Lü2KangZHENG,Li2XiaDENG,QiaoZHANG(DepartmentofGeneticResearch,SunYat2SanUniversityofMedicalScience,Guangzhou,Guangdong510089,China)Abstract:Objectives:Toass
3、esstheeffectoffreezingonthespermDNA.Methods:ToassessthespermDNApreservedat-80℃byusingthesinglecellgelelectrophoresis(SCGE).Results:Therewasnostatisticaldifferenceonthetimefactorbyanal2ysisofvariance(ANOVA).Conclusions:IntegrityofspermDNAcouldnotbedevastatedi
4、nfrozenstates.NatlJAndrol,2002,8(4):253～254Keywords:Freezing;Sperm;DNA;Singlecellgelelectrophoresis在生殖遗传学实验中,由于精液取材困难,通常6精子密度(61～197)×10/ml,平均(123±48)×对精液标本不做特殊处理,直接于冰冻条件下保610/ml,;a级精子30%～60%,平均(49±10)%。[1]存。随着生殖医学的发展,精子的超低温保存已所有捐精者均无烟酒史,无放射线接触史。[2,3]成为相对成熟稳
5、定的技术。大量的文献对于精1.2实验材料低熔点琼脂糖(LAM)、正常熔点液的保存条件、保存方式及冰冻复苏等问题进行了琼脂糖(NAM)、肌氨酸钠、溴化乙锭(EB)购自Sig2研究,但是目前少有人对精子冰冻后DNA成分的ma公司。蛋白酶K购自Merck公司。余试剂购自变化进行分析,本实验目的在于,采用改进后的单细广州化学试剂厂。电泳仪为北京六一仪器厂DYY2胞凝胶电泳法(singlecellgelelectrophoresis,7B型电泳仪,荧光显微镜为德国Zeiss。[4]SCGE),分析冰冻是否引起精子DNA的
6、损伤。1.3实验方法将8份新鲜标本分装,150μl/管,于$80℃冰箱中保存。分别于当日(新鲜标1资料与方法本)、1个月、2个月取出标本(冰冻标本取出后立刻1.1一般资料人精液标本来源于广东省计划生放入37℃水浴箱内解冻),用不含钙、镁离子的pH育研究所。捐精者年龄24～36岁,平均(31±4)岁;714PBS液洗涤2次,2000×g离心5min。PBS调X收稿日期:2001207213;修回日期:2002204219基金项目:中华医学会(CMB)及广东省自然科学基金资助(0013334)作者简介:宋博(197
7、02),男,陕西西安市人,硕士,从事临床生殖医学及科研工作,现在北京大学深圳医院生殖外科工作。E2mail:songbo58@163.com通讯作者:郑履康·254·中华男科学2002年8月第8卷6细胞终浓度为(4～6)×10/ml。将PBS溶解的浓DNA损伤的影响。度为6.5g/LLAM与细胞悬液按照71∶比例于模具随着生殖医学的发展和精子库的出现,人们对内混合,10℃放置8min。加入细胞裂解液[2.5精子的保存越加重视,目前多以液氮为储存剂,以甘mol/LNaCl,100mmol/LEDTA,10mmol
8、/LTris,油、DMSO等为保护剂,采用逐步降温法于超低温[6]10g/L肌氨酸钠,pH10,临用前加10g/LTritonX2状态下保存精子。普通实验中通常将精液标本100,10%(V/V)DMSO],10℃放置1h。吸去残直接低温保存。一般认为冰冻条件下DNA比较稳[7]液,加入酶消化液(2.5mol/LNaCl,5mmol/LTris,定,其完整性不会被破坏。Steele等对冰
