实验3---悬浮细胞的培养

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1、YUNNANNORMALUNIVERSITY本科学生实验报告姓名王冬梅学院乞命科学学院专业应用生物教育班级实验课程名称指导教师及职称开课学期2010至2011学年下学期上课时间2011年3月〜6月云南师范大学教务处编印实验三：胡萝卜细胞的悬浮培养一、实验目的：了解植物细胞悬浮培养的基本原理，通过实验掌握植物细胞悬浮培养的方法和技术。并通过实验练习和巩固无菌操作技术二、基本原理利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在植物遗传实验中己经得到广泛的应用。但这种方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培

2、养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、槓物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。一般的操作过程是把未分化的愈伤组

3、织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100〜120r/min的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。在液体悬浮培养过程屮应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18〜25d时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若

4、从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。三、器材超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、恒温空气摇床、银子、锥形瓶等。四、操作步骤：胡萝卜细胞的悬浮培养培养基的配制配方：MS+RT(0.5mg/l)+2,4・D(l)+LH(100)+C(30g/l)

5、PH:5.8胡萝卜细胞的悬浮培养将前面培养好的胡萝卜愈伤组织。如下：挑选增殖良好的转移到200ml的三角瓶中，瓶内装有一定量的液体培养基，将三角瓶置于摇床上，转速100r/min,25rH光照培养。进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞生长速度有关，因此当发现培养瓶中培养物密度较大时，应及时用无菌的吸管吸取部分培养物到一新的50mL培养基中继续培养。同时还要及时淘汰一些大的组织团块和黄褐色的坏死组织。一般每隔4〜7d就要继代一次。本次实验基本成功，但其中也有不足

6、之处，所以需要再接再厉，做得更好。不足Z处：经观察悬浮培养基中的细胞碎片较多，这可能是摇床的速度偏大导致，所以适当降低转速估计可以降低细胞的碎片。组织培养当中的无菌操作是必须条件，养成良好的习惯对实验的成败十分有帮助，所以应注意无菌操作技术的熟练。同时，在悬浮培养当中要注意实验阶段各个环节的细节，使细胞悬浮培养达到最优的效果。