最权威最齐全的PCR汇总及其原理,程序

《最权威最齐全的PCR汇总及其原理,程序》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、RTPCRTPCR-RT-PCR简介反转录•聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)是将RNA的反转录(reversetranscription)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录嗨的作用从RNA合成cDNA,旳以cDNA为模板，扩增合成冃的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞屮基因表达水平，细胞屮RNA病毒的含量和肓接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无

2、论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA陆和基因组DNA的污染。RTPCR-原理只要是利用相关技术提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用反转录酶反转录成cDNAo再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RTPCR-过程RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在反转录缓冲液小进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，在同时为反转录和PCR优化的条件下，反转录和P

3、CR在一直观众顺次进行。1、反转录酶的选择RT-PCR两种方法連用予rnRNAIt这受群析•TwoStepRTPCR叢早古•

4、种。对于短的不具冇发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可。一步法实匕示意0B（卿一个反总管中）<-d步法RT-PCR引物的选择:1•随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNAo确于rRNA>niRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。合成法示倉8B（两步济》•◄u

5、解也会使全长cDNA合成儀人人减少。3.基因特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的悄况。RTPCR-影响因素RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度，引物退火的温度，扩增的循环数等。1、建议选择0.5-3.0mM（相差0.5mM）的硫酸镁作初步实验。2、对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。3、人多数口标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果口标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。反向PCR反

6、向PCR是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的DNA,也就是说这一反应体系不是在一对引物Z间而是在引物外侧合成DNAo反向PCR-简介PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCRnJ'扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。反转录PCR反转录PCR又称为逆转录PCR,,是指扩增mRNA的一种实验技术。先将mRNA反转录成cDNA,然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。3・PfiEXlAZBmRlWmRUACWAJWAAAg1SuperRnaseK伍TjReverseTransmptasc3^PC

7、RTWVTTTTTTRT-PCR反应原理反转录PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)乂称为逆转录PCR。其原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,釆用0ligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得冃的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了儿个数虽级，使一些极为微屋RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA髙效转

8、录系统。RT-PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)即逆转录PCR,是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。RT-PCR