DNA合成常见问题解答资料

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1、DNA合成常见问题解答1．DNA合成粗产物中含有什么杂质？DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后，其中除了含有所需的目的DNA片段(n)以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段(n-1,n-2,…)以及脱保护基团产生的铵盐。需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。2．如何进行合成产物的纯化？目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种：A)C18柱脱盐，这是一种活性炭柱子，有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。

2、实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5'端一个或两个或多个碱基的产物，却一般不会对普通PCR反应产生影响。但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别，以免后患无穷。B)OPC柱纯化，OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的Dmt，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有Dmt的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有Dmt的片段吸附能力弱，被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。这种方法的优点

3、是快速，简易。但是其专一性吸附Dmt能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好。C)HPLC纯化，这是国外厂家常常使用的办法。它是依据不同大小的片段带有的净电荷多少来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。它的优点是自动化程度高、省人力；缺点是纯化量小、不能纯化长片段(对于长于40碱基的片段，无法纯化)。D)PAGE纯化，几乎所有专业书籍上

4、介绍的最佳纯化方法。它是依据DNA片段在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时的迁移率不同来分离大小片段的。由于各分子所带电荷和大小不同，综合影响其在凝胶中的迁移速度，大片段迁移得慢，经过一定时间的电泳，大小片段会分开，然后停止电泳，剥离凝胶，置于荧光TLC板上在紫外灯下切割目的条带，浸泡碎胶，并从泡胶的盐溶液中回收目的DNA。优点是纯化效果很好、尤其是纯化长链效果更好、而且是可以直观看见DNA片段合成情况的质控环节。通常认为的缺点是实验室水平的PAGE纯化实验步骤多费人工、电泳及后处理过程样品损失量大、电泳装置局限或电泳时间如果不够会影响纯化效果。

5、但这些缺点完全可以克服。我们通过扩大规模流水作业使实验过程便于掌握和节省人力；在粗样品中加入尿素饱和液增加样品比重减少电泳上样的损失；改用C18柱回收产物，使得回收效率大大提高；通过特制电泳装置，增加凝胶厚度和长度来增加负载量和分离效果等等。所以我们一直使用PAGE纯化方式保证合成产物的纯度。为了保障您的后续实验，请您选用PAGE纯化的产品，特别是现在DNA合成不同纯化方式的价格相差不多的情况下。3．如何测定引物的OD值？用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2

6、-0.8之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50微升稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的光密度为0.25，说明该50微升中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。4．如何检测引物的纯度？实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入

7、尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带。)5．怎样按照使用浓度溶解引物？记住几个参数：1OD引物干粉约为33微克；碱基的平均分子量为324.5；引物的分子量=碱基数x碱基的平均分子量；引物的摩尔数=质量数/引物分子量举例：如果您拿到一管标明为2OD的20碱基的引物，分子量=20x3

8、24.5=6490质量数=2x33=66μg摩尔数=66/6490=0.010μmol=10nmol若您需要溶解为10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。同