人抗肾小球基底膜抗体(gbm)酶联免疫分析试剂盒

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1、人抗肾小球基底膜抗体（GBM）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供体外研究使用!预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中GBM含量。实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗GBM抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗GBM抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GBM呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）2.标准品（冻干品）：

2、2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10ng/ml，做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释）后，分别稀释成10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，1.25ng/ml，0.625ng/ml，0.312ng/ml，0.156ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0ng/ml，临用前15分钟内配制。如配制5ng/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）10ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。3.样品稀释液：1

3、×20ml。4.检测稀释液A：1×10ml。5.检测稀释液B：1×10ml。6.检测溶液A：1×120μl（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。7.检测溶液B：1×120μl/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。8.底物溶液：1×10ml/瓶。9.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10.终止液：1

4、×10ml/瓶（2NH2SO4）。11.覆膜：5张12.使用说明书：1份自备物品1.酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）2.微量加液器及吸头，EP管3.蒸馏水或去离子水，全新滤纸标本的采集及保存1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。3.其它生物标本：请1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标

5、本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。4.样本处理：血清或血浆标本推荐稀释10倍，如：稀释10倍，取100uL血清或血浆加入900uL样品稀释液。标本使用0.1M的PBS稀释（PH=7.0-7.2）。注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1个月，-80℃不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。操作步骤实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使

6、稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μ（在使用前一小时内配l制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干

7、（也可轻拍将孔内液体拍干）。4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。8

8、.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止