实验_紫外分光光度法测定蛋白质含量

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1、分光光度法分光光度法的原理Lambert-Beer定律（光吸收定律）溶液的质量浓度（C）越大，液层厚度（L）越厚，则溶液对光线吸收得越多。当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即K吸光系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光物质的浓度成正比。所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的含量。入射光I0出射光It反射光IrIa吸收光It／I0＝TT（transmittance）称为透光度，表示透过光的强度是入射光强度的百分比。A∝C光密度与浓度成正比T与C成反比，浓度愈大，T愈小A=-lg=KCLTA（Absorbance）称为吸光度，指溶液对光线的吸收程度

2、又称为光密度（Opticaldensity，OD）。分光光度法的应用用标准管法计算待测液浓度在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），及未知浓度（CU）溶液的吸光度（AU），根据定律得：AU=KUCULU；AS=KSCSLS因为KU=KS，LU=LS所以AS与AU之比值也等于两浓度之比值即AU/AS=CU/CS，CU=AUAS×CS分光光度法的应用用标准曲线法求出待测溶液的浓度先配制一系列已知浓度的测定物溶液，分别测得各管的吸光度。以各管吸光度为纵坐标，测定物含量为横坐标；在方格坐标纸上作图即得标准曲线图。吸光度A蛋白质浓度C（μg/ml）0

3、.20.40.6....4080120160分光光度法分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。特点：分光光度法灵敏度较高、精确度高、操作简便、快速。分光光度法所使用的光谱范围主要是波谱图中200～1000nm为一段波长的光谱。紫外光区200～400nm可见光区400～760nm红外光区760～1000nm分光光度计的基本结构光源单色光器吸收池测光机构钨丝灯氢灯氘灯棱镜衍射光栅玻璃比色杯石英比色杯硒光电池光电管光电倍增管将光能转变为电能，光电流的强弱与溶液的吸光量强弱有关。开机，预热20~30分钟转动波长旋钮，调所需波长。调零测

4、量并读数结束/关机清洗比色杯，收拾好仪器及配件，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。分光光度计使用的注意事项试管架或试剂瓶不得放置于仪器上，以防试剂溅出腐蚀机壳。拉杆动作要轻，防溶液溅出，腐蚀机件。比色杯应与分光光度计相配对，禁止随意挪用。比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。盛液时不能太满（约达比色杯2/3体积），外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉。原理大多数蛋白质都含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。这些氨基酸有苯环共轭双键，在紫外光区280nm显示最大光吸收，且吸光度与

5、浓度成正比。蛋白质定量——紫外分光光度法试剂配制表（ml）试管012345标准蛋白质溶液（1mg/ml）——0.51.52.54.01.0（待）蒸馏水4.03.52.51.5——3.0浓度00.1250.3750.6251A280蛋白质定量——紫外分光光度法1.标准管法（以第三管为标准管）蛋白质定量——紫外分光光度法结果处理A测A标×C标×4（稀释倍数）C测=2.标准曲线法以标准管浓度为横坐标，标准管吸光度为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。根据待测管的吸光度，从标准曲线上查出待测溶液的浓度并乘以稀释倍数。