干扰RNA与肿瘤治疗研究现状及展望

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1、干扰RNA与肿瘤治疗研究现状及展望1提纲概述RNAi的发现RNAi作用机制RNAi的技术的应用及实验步骤RNAi作用的特点RNAi与肿瘤治疗SiRNA的转导存在的问题与展望2概述RNA干扰(RNAinterference,RNAi)：又称为转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。其原理是将特异性双链RNA(dsRNA)导入细胞，诱导同源的mRNA降解，导致目的基因表达沉默或表达水平下降。2001、2002年连续被Science评为年度十大成就之一！3RNAi

2、的发现41990年Jorgensen等矮牵牛花颜色加深实验共抑制(co-suppression）51995年Guo和Kemphues反义核酸技术关闭秀丽隐杆线虫(C.elegans)par-1基因的表达实验（秀丽隐杆线虫）研究者对此现象无法解释61998年Andy.ZFire和Craig.CMello等秀丽隐杆线虫（C.elegans）反义RNA抑制实验7(uninjected,mex-3probe)(antisensemex-3RNA,mex-3probe)(double-strandedmex-3RNAinj

3、ected,mex-3probe)(uninjected,noprobe)将这一现象称为“RNA干扰”81999，2000年92001年1011RNAi作用机制12RNAi作用机制图识别并降解mRNA启动阶段效应阶段Dicer的切割RISC的形成与激活倍增阶段131.启动阶段长dsRNA进入细胞后，首先被Dicer酶特异性地裂解成21～23核苷酸（nt）的siRNA，Dicer的切割2.效应阶段RISC的形成与激活siRNA结合到RNA诱导的基因沉默复合体（RISC），该复合体依赖ATP释能而解聚siRNA双链成

4、单链以激活RISC。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA，导致基因沉默效应识别并降解mRNA3.倍增阶段siRNA一方面可引导RISC特异性剪切同源单链mRNA，使mRNA降解。另一方面siRNA还可作为引物与靶向mRNA结合，在RNA依赖性RNA多聚酶(RdRP)的作用下合成新的dsRNA，新合成的dsRNA再次经Dicer酶切割，形成新的siRNA，并作用于靶向mRNA。如此反复、倍增，从而使RNAi的作用进一步放大，最终使靶向mRNA全部降解。

5、RNAi作用的特点1高序列特异性2高效性3浓度、时间双重依赖性4RNAi作用的靶基因位点有选择性5可传播性6可遗传性17RNAi技术的应用及实验步骤18RNAi与肿瘤治疗1.封闭原癌基因2.封闭细胞凋亡相关基因3.封闭周期相关基因4.封闭肿瘤血管生成相关基因5.封闭肿瘤转移相关基因6.封闭耐药基因b肿瘤相关mRNA降解ac191.封闭原癌基因骨桥蛋白(osteopontin，OPN)在大多数胃癌中过表达，并与胃癌的发病相关，RNAi抑制人胃癌细胞中的OPN的表达，能有效抑制胃癌细胞的生长、迁移和侵袭。研究表明肾癌

6、细胞中检测到OPN的表达，利用siRNA下调OPN的表达后伴有线粒体相关凋亡通路的激活以及MMP-2和uPA等侵袭相关蛋白的表达下调，显著增加肿瘤细胞的凋亡同时减少其侵袭能力。202.封闭细胞凋亡抑制基因在肿瘤的发病机制中凋亡受抑是肿瘤细胞恶性克隆增殖的基础。凋亡抑制蛋白家族(inhibitorofapoptosisproteins，IAPs)是一类结构上相似的蛋白质，目前已发现了8种IAP:X染色体相关IAP(XIAP)，细胞IAP(c-IAP1，c-IAP2)、神经元IAP、Survivin、Apollon、

7、Livin、和IAP样蛋白-2。212.封闭细胞凋亡相关基因Ma等研究发现c-IAP1，c-IAP2在骨肉瘤中表达升高，并且利用RNAi封闭c-IAP1，c-IAP2后可抑制骨肉瘤的生长。223.封闭周期相关基因CyclinE是细胞从G1期到S期转变的关键分子,在许多肿瘤细胞中高表达,Todd等[21]发现在70%的RB+/p16+卵巢肿瘤中cyclinE表达异常增高，利用siRNA抑制cyclinE的表达后，肿瘤细胞大量蓄积于G1期，从而认为cyclinE是卵巢癌又一潜在的治疗靶点。细胞周期蛋白(cyclin)

8、D1作为细胞周期调节因子之一，其过表达是多种人原发性肿瘤的特征，对肿瘤的诊断和预后判定具有重要意义。Deharvengt等[22]在胰腺癌中利用靶向cyclinD1的shRNA降低cyclinD1蛋白水平，能减少肿瘤细胞体外生长和侵袭及体内肿瘤血管形成。234.封闭肿瘤血管生成相关基因VEGF被认为是最主要的血管生成因子，Yang等根据VEGF的基因序列设计了特异性的si