细菌基因组DNA提取试剂盒(溶液型)操作方法及步骤说明书

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1、细菌基因组DNA提取试剂盒(溶液型)操作方法及步骤说明书　　杭州昊鑫生物科技股份有限公司　　htpp://细菌基因组DNA提取试剂盒　　目录号：DN12目录编号DN1201DN1202DN1203　　适用范围：　　适用于快速提取各种细菌基因组DNA　　试剂盒组成、储存、稳定性：　　保存室温室温室温-20℃　　包装单位50次100次200次　　试剂盒组成细胞核裂解液蛋白沉淀液DNA溶解液RNaseA(10mg/ml)　　50次30ml10ml10ml150μl　　100次60ml20ml15ml250μl　　200次120ml40ml30ml400μl　　本试剂盒在室温储存1

2、2个月不影响使用效果。储存事项:1.　　环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，轻轻旋摇，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。　　-1-　　杭州昊鑫生物科技股份有限公司　　htpp://　　2.　　蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。3.　　避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。　　产品介绍：　　本试剂盒用于快速的从各种细菌中提取基因组DNA。细菌样品加入细胞核裂解液(或者通过溶菌酶

3、或者其它一些酶帮助裂解细胞壁后)，首先在强去污剂作用下裂解细胞释放出基因组DNA，接着加入RNaseA去除RNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。1.2.3.　　产品特点：　　不需要使用有毒的苯酚等试剂。　　快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。　　结果稳定，产量高，OD260/OD280典型的比值达～，长度可达50kb-150kb，可直接用于构建文库，PCR，Southern-blot和各种酶切反应。　　1.　　注意事项　　所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机

4、，如Eppendorf5415C或者类似离心机。2.　　用户需自备异丙醇、70％乙醇、EDTA和Lysozyme(用于革兰氏阳性菌)、lysostaphin(用于某些难裂解的革兰氏阳性菌)、水浴箱。3.4.　　开始实验前将需要的水浴先预热好备用。　　本试剂盒为溶液型，可以很容易的按照比例扩大或者缩小每次处理的细菌细胞　　-2-　　杭州昊鑫生物科技股份有限公司　　htpp://　　量，请联系我们索取其它处理量的操作手册。1.2.　　操作步骤：收集1毫升过夜培养细菌加入毫升离心管。　　9,000rpm离心30秒，使细胞沉淀下来，弃上清，涡旋或轻弹打散细胞沉淀。对革兰氏阳性菌，接

5、步骤3。对革兰氏阴性菌，直接接步骤6。3.4.　　加入480μl50mMEDTA完全重悬细胞。　　加入120μl溶菌酶(20mg/mlin10mMTris-HCl，pH)，混匀。　　对于大部分的革兰氏阳性菌如Bacillussubtilis，Micrococcusluteus，Arthrobacterluteus，Nocardiaotitidiscaviarum，Rhodococcusrhodochrous和Brevibacteriumalbidium，使用溶菌酶就可以有效裂解。但是对于某些种类的Staphylococcus，则应该加入60μl溶菌酶(20mg/ml)和60

6、μllysostaphin(20mg/ml)确保有效裂解。5.6.7.8.　　37℃温育30-60分钟。12,000rpm离心2分钟，弃上清，涡旋或轻弹打散细胞沉淀。加入600μl细胞核裂解液至打散的细胞，轻柔吹打裂解细胞。80℃温育5分钟裂解细胞，然后冷却至室温。　　加入μlRNaseA至裂解物中至终浓度30μg/ml。颠倒混匀后37℃温育15-60分钟去除残留RNA。然后室温冷却至少5分钟使回复到室温。9.　　在回复到室温的裂解物内加入200μl蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀25秒。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。冰浴5分钟。　　于样品体积重量小，用涡旋振

7、荡器振荡混匀产生的剪切力并不会剪切打断基因组DNA。如果用手振荡混匀，则不可以用手上下剧烈振荡混匀，只能适当力度振荡混匀，否则会剪断基因组DNA；但是力度也不能小，要保证充分混匀，将粘稠的裂解物打散开，否则DNA无法和蛋白质沉淀分离开，离心的时候会和蛋白质一起沉淀下来，造成DNA丢失或者降低产量。此外混匀不充分也可能造成　　-3-　　杭州昊鑫生物科技股份有限公司　　htpp://　　蛋白沉淀不充分，最后的产物污染有较大量的蛋白质。因此建议用涡旋振荡器。10.13,000rpm离心5分钟。这时候应该可以见到管底白色的