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1、‘ICs67100X04中华人民共和国国家标准GB/T22287—2008贝类中甲型肝炎病毒检测方法普通RT—PCR方法和实时荧光RT—PCR方法Detectionofhepatitisavirusinshellfish-ContentionalRT-I'CRandreal-timefluorescenceRT-PCR2008-08-12发布200⒏12-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布o"EE"'中国国家标准化管理委员会HEMfi食品伙伴网http://www.foodmate.netGB/T22287-2008日刂吕本标准的
2、附录Λ为规范性附录.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本标准起草单位:中华人民共fn国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准上要起莘人:陈广全、饶红、段洪安、冯骞、付溥膊、张惠媛、汪琦、曾静、张睿、李金华.食品伙伴网http://www.foodmate.netCB/Γ22287-2008贝类中甲型肝炎病毒检测方法普通RT—PCR方法和实时荧光RT-PCR方法I范围本标准规定了贝类中甲型肝炎病毒的普通RTPCR和荧光RTPCR检测方法.本标准适用于贝类中甲型肝炎病蓐核酸的检测。2规范性引用文件卜列文件中的条款
3、通过本钚准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的扌l丿lJ文作,其随后所礻f的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准、然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否nr使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引川文件,其最新版本适用于本标准.GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GlJ/T66822008,IS03696:1987,M()D)GI;l阢89实验窀生物安全遁丿丨:耍求SN/T1193萎囚分析检测实验室技术要求3术语和定义阝列术语和定义适川于本标准。31聚合酶链式反应polymerascchaInrcaction,PCR
4、DNΛ模板先经高温变性为单链,在适宜的温度卜和缓冲液中,两条引物分别与模板DNΛ两条链L的一段IL补序列发FL迟火,接着在I)NΛ聚合酶的催化下以四种dN'ΓP为底物,使,Il火引物得以延仲,如此反笈变性、迟火和延仲,使位于两段引物序列之问的DNΛ片段呈几何倍数扩增.32-聚反转录合酶链式反应Ieversetranscriptionpol,merascchaIIlrcaC1it,n,R1-I’CRRNΛ在逆转录酶的作用下,适宜反应条件下,被逆转隶成cI)NΛ,以cDNΛ作为模板进行PCR。33—实时荧光R1′PCRrea⒈“mefIuoresce
5、nceRT—PCR实时荧光RTPCR方法是在常规RTPCR的基础上,加人一条特异性的荧光探针.该探针为一段寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,T〃q酶的5’3’夕卜切酶活性将探针酶切降解,便报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可以接收到荧光信号,即每扩增-条DNΛ链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物肜成完仝同步。34Ct值qc】ethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数.4缩略语F列缩略语适丹j于本
6、标准.l食品伙伴网http://www.foodmate.netCB/T22287—200841HΛV:甲型肝炎病毒,42TCID:0:组织培养半数感染量,是病毒感染一半组织细胞时的病毒稀f+·度,一般使用ReedMuencb方法计算。5试剂除有特殊说明外,所有实验llJ试剂均为分析纯;实验用水均为去离子水,规格符合GB/T6682相关规定。51甘氨酸缓冲液:见附录Λ中的Λ11.52PEG8000沉降液:见附录Λ中的A12,53裂解液;Thzo⒈rcagcnt或其他等效产nll。50P。ly(dt)磁珠:Dyndbcadsohgo(dt)25或萁
7、他等效产品。一注:给出这信虑是为了方便本标准使用者,并不表示对该产品的认可.如果其他等效产品具有相同的效果,则可便川这些等效产品Ⅱ551×RNA吸附缓冲液:见附录A中的A.2.5。562XRNΛ吸附缓冲液:见附录A中的A.2.6。57洗涤缓冲液:见附录Λ中的Λ。2.7。58QIΛamPⅥ洌RNAMiniKit(QIagensz9001)”或其他等效产甜,59suI)crscri【)tTMonc灬tcpItT—PCRwithplatinun1△aq(InvltrogcnCatNol0928031)Ⅱ或其他等效产宀宀.⋯510SupcrschⅡsrs
8、tstrandsyhthes0systemforRT—I)CR(Invitr。gcnCatN。18080051)”或其他等效产品。5ll
