截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、多克隆抗体制备及鉴

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1、截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达.多克隆抗体制备及鉴【摘要】目的：构建截短型鸭乙型肝炎病毒(DHBV)核心蛋白的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达，制备多克隆抗体。方法：应用基因工程技术将编码截短型DHBV核心蛋6(DHBcAg1-214aa)的基因片段装入原核表达载体pRSETB内，在宿主Rosetta(DE3)pLacI内进行诱导表达，运用NiNTA方法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，并采用酶联免疫吸附实验(ELISA),Westernblot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功地构建了含截短型DHBV核心区基因的质粒，并纯化得到

2、了相对分子质量(Mr)约为28000的目的蛋白,用之免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论：获得的重组截短型DHBV核心抗原纯度高，免疫反应性强；获得的多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性，为DHBV的检测和研究奠定了实验基础。【关键词】鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达载体多克隆抗体鸭乙型肝炎病毒(duckhepatitisBvirus,DHBV)与人乙型肝炎病毒(HBV)同属嗜肝DNA病毒科，被广泛用于研究嗜肝DNA病毒的复制机制、细胞表面病毒受体、病毒清除机制和筛选新的抗病毒药物的动物模型。DHBV主要编码外膜蛋白、核心蛋白和P蛋白，其中核心蛋白(DHBcA

3、g)分子约262个氨基酸,其氨基端有装配核心颗粒，竣基端有结合核酸的功能⑴。最近研究中，Thermet等[2]通过对DHBcAg和HBcAg抗原决定区(AR)的上匕对，得出DHBcAgAR5与HBcAgAR2相似的结论，并结合文献报道HBcAg按其功能的不同大致可分为装配区(1~144aa)和核酸结合区(145-183/185aa)[3]o本研究中我们将DHBcAg从AR5后的214位氨基酸截取，构建截短型DHBV核心蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌中表达，制备多克隆抗体。1材料和方法1.1材料限制性内切酶XhoLPstLT4DNA连接酶、LATaq蛋白marker、DL2000

4、购自TaKaRa公司。NiNTASpinColumnkit购自德国Qiagen公司。鼠抗His单克隆抗体(mAb)和HRP标记羊抗鼠IgG为美国SantaCruz公司产品。GeneRulerTM1kbDNALadder购自立陶宛MBI公司。异丙基0D硫代半乳糖昔(IPTG)购自美国Promega公司。Westernblot试剂盒购自Pierce公司。DYY5型双稳定时电泳仪、DYCZ24D型迷双垂直电泳槽及DYCZ40D型迷转移槽均购自北京六一仪器厂。生物素标记羊抗鼠IgG免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。氢氧化铝佐剂购自武汉生物制品研究所。引物合成及序列测定由上

5、海英俊生物技术有限公司完成。重组表达质粒PCR2.1DHBV1.5[4],含T7启动子的原核表达载体pRSETB,宿主E.coliDH5a、表达E.coliRosetta(DE3)pLacI由本室保存。6~8周龄雌性BALB/c小鼠，由同济医学院实验动物中心提供。1.2方法1.2.1重组质粒的构建及鉴定根据GenBank提供的序列(DQ276978)分别设计上游引物CP1(2650~2668nt)5QCGCTCGAGGGATATCAATGCTTCTA3引入酶切位点Xho1(框中部分，下同);下游引物CP2(250〜267nt)5’TACACTGCAGCAGGTTCAAGTCC

6、ACGAGG3；弓I入DHBV1.5质粒为模板,PCR扩增DHBcAg1-214氨基酸的编码序列，反应的条件为：94°C10min预变性，随后94°C45s,50°C45s,72°C50s,共30个循环，最后729延伸10mino扩增相应片段后回收纯化PCR产物用XhoI和PstI进行酶切，然后与同样双酶切的原核表达载体pRSETB回收纯化后，用T4DNA连接酶169连接12h,连接产物转化DH5a菌后挑取克隆，用PCR和酹切法鉴定正确后进行测序分析，该重组质粒命名pRSETBDHBc214o此载体在目的片段的N端有6个His,以便于表达后的鉴定与纯化。1.2.2重组质粒的诱导

7、表达取重组质粒pRSETBDHBC214转化到E.coliRosetta（DE3）pLacI,涂板，挑克隆，经PCR筛选及酶切鉴定正确后将含有重组质粒的E.coliRosetta（DE3）pLacI接种于1mLSOB培养液内（含100pg/L氨节青霉素35pg/L氯霉素）,379摇12h左右,4~6以1:50比例接种到10mLSOB培养液内，379摇h至A600=0.4~0.6时加入IPTG至终浓度为2mol/L,37°C250r/min诱导1〜6h。同时取空载体进行同样的转化、诱导。SDS