禽白血病诊断技术

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1、禽白血病诊断技术规程1 范围本规程规定了禽白血病(ALV)临床诊断、实验室诊断的技术要求。本规程适用于辽宁省境内禽白血病的诊断、疫情监测及流行病学调查。本规程中的临床诊断方法为筛选方法,筛选结果为疑似的病禽采集病料进行实验室检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法NY/T680—2003禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验SN/T1172—2003禽白血病琼脂免疫扩散试验J-亚群禽白血病防治技术规范3 临床诊

2、断3.1 临床症状禽白血病病鸡无特异的临床症状,部分患有肿瘤的鸡表现消瘦,头部苍白,并由于肝部肿大而导致患鸡腹部增大。禽白血病感染率高的鸡群产蛋量很低。潜伏期较长,最早可见5周龄鸡发病,但主要发生于18周~25周龄的性成熟前后鸡群。总死亡率一般为2%~8%,但有时可超过10%。3.2 剖检病变特征性病变是肝脏、脾脏肿大,表面有弥漫性的灰白色增生性结节。在肾脏、卵巢和睾丸也可见广泛的肿瘤组织。有时在胸骨、肋骨表面出现肿瘤结节,也可见于盆骨、髋关节、膝关节周围以及头骨和椎骨表面。在骨膜下可见白色石灰样增生的肿瘤组织。4 实验室诊断4.1 病原分离鉴定4.1.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备取10

3、d~12d龄SPF鸡胚按常规方法制备CEF,置于35㎜~60㎜平皿或小方瓶中。待细胞单层形成后,减少维持用培养液中的血清至1%左右。4.1.2 病料的处理和接种4.1.2.1 病料的处理1.1.1.1.1 血清或血浆样品:从疑似病鸡无菌采血分离血清或血浆。1.1.1.1.2 肝、脾、肾组织样品:取1g~2g组织研磨成匀浆后,按1:1加入无菌的PBS,置于1.5mL离心管中10000r/min离心20min,用无菌吸头取出上清液,移入另一无菌离心管中,再于10000r/min离心20min,按10000IU/mL量加入青霉素后备用。1.1.1.1.3 传代培养:用胰酶溶液将感染的CEF单层消化后

4、,再作为第2代细胞接种于另一块带有3~4片载玻片的35㎜~60㎜平皿中,继续培养7d。1.1.2 病毒的检测1.1.2.1 间接荧光试验(IFA):将带有感染的CEF的载玻片取出,用丙酮-乙醇(7:3)混合液固定后,用ALV单克隆抗体或单因子血清及FITC标记的抗小鼠或抗鸡Ig标记抗体做间接荧光试验。在荧光显微镜下观察有关呈病毒特异性荧光的细胞。1.1.2.2 聚合酶链式反应(PCR):从CEF悬液提取基因组DNA作为模板,以特异引物进行扩增,回收产物进行测序;或克隆后测序,将测序结果与已发表的ALV株比较,基因序列同源性应在85%以上。1.2 禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验操作方法见

5、NY/T680—2003。1.3 禽白血病琼脂免疫扩散试验操作方法见SN/T1172—2003。1.4 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)1.4.1 材料1.4.1.1 样品的采集与处理无菌采集病鸡的全血、病变组织,在无菌条件下将样品充分研磨,并加入0.04mol/L PBS(pH7.4)制成1:5悬液,3000r/min离心10min,取上清备用。1.4.1.2 试剂—TaqDNA聚合酶;—AMV反转录酶;—dNTP;—DL2000DNAMarker;—琼脂糖;—核酸提取试剂Trizol;—氯仿;—异丙醇;—DEPC水;—ddH2O;—75%乙醇(DEPC水配制)。1.4.2 方法1.4

6、.2.1 样品总RNA的提取1.1.1.1.1 取上清液250μL加入用DEPC水处理过的1.5mL离心管中,加入750μLTrizol病毒裂解液,颠倒混匀。阳性对照、阴性对照与样品同时提取RNA。1.1.1.1.2 室温静置5min,加入250μL氯仿,混匀。1.1.1.1.3 静置2min,4℃12000r/min离心10min。1.1.1.1.4 小心吸取上清液加入另一干净的用DEPC水处理过的1.5mL离心管中,再加入等体积的异丙醇,混匀。1.1.1.1.5 静置5min,4℃12000r/min离心10min。1.1.1.1.6 小心倒掉上清液,加入1000μL75%的乙醇(用DEP

7、C水配制);4℃13000r/min离心2min。1.1.1.1.7 小心倒掉上清液,置37℃温箱5min。1.1.1.1.8 加40μLDEPC水溶解,-70℃保存。1.1.1.2 反转录反应(RT反应)在0.2mlPCR管中配制如下体系:—下游引物1μL;—RNA模板1μL;—5×RTBuffer2μL;—dNTP(10mM)1μL;—RNA酶抑制剂0.5μL;—AMV反转录酶0.5μL;—D

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