质粒DNA的提取

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1、§2质粒DNA的提取一、实验目的本实验通过质粒快速提取试剂盒的试剂对大肠杆菌中的重组质粒pET22b的抽提，掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。二、实验原理载体是基因工程所必需的工具，它用于将目的基因运载到宿主细胞内的克隆与表达。自然界的质粒经改造以后，常被用作基因工程技术的基因载体。常用的载体有质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、逆转录病毒DNA和昆虫病毒DNA等，而质粒是最常用的载体。细菌质粒是存在于细菌染色体外，能够独立复制的环状DNA。质粒DNA小量制备是基因工程操作中的常规技术，提取的质粒DNA可用于酶切、连接与转化等。从大

2、肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离可依据并选择利用DNA分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构等特点来进行。常用的有碱变性抽提法，羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法，两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上各种方法均有利弊，因此在制备质粒DNA时，要根据以下几个方面进行比较，选择最佳的实验方法：（1）质粒特性：如质粒宿主的菌属，是否需要用溶菌措施。质粒DNA的大小，分子量大的在制备过程中易受损伤，DNA易产生缺口；拷贝数、构型、复制型是否需要氯霉素扩增等。（2）提取质粒DNA的用量与用途：如用于初筛比较分子量大

3、小、进行酶切、作探针或测序等。（3）提取方法的成本、程序、重复性、纯度以及实验室具备的条件等。目前实验室中最常用、最有效的方法为碱变性抽提法和溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法两种。碱变性抽提法效果良好，既经济且收得率较高。提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。但该法如操作不慎，会影响纯度，且步骤复杂，费时较多。对于分子量较大拷贝较少的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，因此选用氯化铯密度梯度超离心法抽提DNA，该法具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质粒DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用小量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于后续的操

4、作。本试剂盒是由上海申能博采试剂公司提供的，其原理是采用碱裂解——中和法。该法抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，存在于溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀而被除去。再进一步利用酚，氯

5、仿这两种蛋白质变性剂去除蛋白杂质，用无水乙醇沉淀质粒DNA，得到纯化的质粒DNA。采用碱裂解——中和法，应用常规台式高速离心机，经反应条件最优化后，使含有质粒DNA的上清通过设计独特的离心吸附柱式结构时，被特殊硅基质材料高效、专一地吸附。被吸附的质粒DNA随后可用洗脱缓冲液从离心吸附柱上洗脱下来，本试剂盒有以下特点：（1）快速方便——半小时完成一次实验，并能在一小时左右，同时处理10-20个质粒样本，操作简便。（2）高效优质——省略苯酚、氯仿的抽提，减少了对质粒DNA的破坏。从2-3ml菌液可提取出约15-20μg质粒DNA，其中超螺旋结构占90%以上，并

6、且也无蛋白质、盐类、有机化合物的污染，可用作测序模板和其它酶促反应。三、仪器和试剂（一）仪器：高速离心机、螺旋混合器、冰盒、计时器、1.5mlEppendorf离心管。（二）试剂：已培养的菌液、质粒快速提取盒（上海申能博彩试剂公司）、无水乙醇。四、实验步骤（一）准备工作：1.试剂公司将质粒快速提取盒送到实验室后，应立即将已加RnaseA的Solution1置于4℃冰箱保存。2.Solution2及Solution3如有白色沉淀、高盐结晶析出，请将瓶盖拧松后置于微波炉连续加热10-15秒，或37℃以下保温溶解，摇匀后使用。确保每使用完一种试剂后，立即盖紧该试

7、剂瓶的瓶盖。3．使用前，必须在22mlWashSolution瓶中加入50ml无水乙醇，充分混匀后使用，或按WashSolution：无水乙醇为11：25的比例，用多少配多少。（二）实验步骤：1．收集1.5-3ml菌液于1.5mlEppendorf离心管中，12000rpm离心1min，彻底弃去上清，管底保留沉淀菌体。如果菌体量太少，可再重复收集一次。2．加入100μlSolution1，用移液器或振荡器彻底悬浮细菌。注意：（1）为了获得高质量的质粒DNA，培养细菌的时间不宜过长，一般为12个小时。如果是高拷贝质粒，1.5ml细菌将获得足够的DNA，对于低

8、拷贝数的质粒，用5ml细菌；质粒如果用于全自动荧光测序，用5ml细